收藏！Biacore竞争实验3大主流设计方案全解析

生物分子间的相互作用是理解生命活动的基础，实际体系也往往涉及多分子的竞争或协同作用。在药物研发中，还可通过判断分子间是否存在竞争关系，明确其是否结合于相同或重叠位点，从而揭示其作用机制。

随着SPR技术的发展，基于Biacore分子互作检测平台的竞争实验已形成从Sample mix、Buffer mix到Dual与A-B-A injection的一整套成熟且灵活的设计体系，今天，Cytiva汇总了以上各类型的Biacore竞争实验设计方案，供大家参考。

经典竞争实验设计

Sample mix是指竞争分子与分析物样品混均后，比较含有和不含竞争分子的样品测试结果（图1）。适用于Biacore所有机型。

图1：Sample mix竞争实验设计图

北京大学医学部曾克武和屠鹏飞教授团队在ACS Cent Sci.上发表题为“Allosteric Regulation of IGF2BP1 as a Novel Strategy for the Activation of Tumor Immune Microenvironment”的研究论文，揭示了天然产物中抗肿瘤活性分子-葫芦素（CuB）的发现及作用机制。

本研究中，作者使用了Biacore完成从靶点确认—抑制剂筛选（竞争法筛选）—亲和力/动力学表征—竞争实验的一系列分子机制研究。

其中竞争实验的实验设计为Sample mix的方式，作者将固定浓度的ss-m6A与浓度逐渐增加的CuB混在一起流经IGF2BP1表征CuB的抑制效果，从结果可以看出，随着CuB浓度的逐渐提高，IGF2BP1与ss-m6A的结合信号越来越低（图2）。

且Biacore检测结果与RNA pull-down实验一致，明确了CuB可以抑制二者结合。

图2：CuB存在的情况下Biacore检测IGF2BP1与ss-m6A的相互作用

Buffer mix是指将竞争分子加入到运行缓冲液中，与缓冲液中不添加竞争分子的实验结果进行对照（图3），适用于Biacore所有机型。

图3：Buffer mix竞争实验设计图

Buffer mix需要进行两次独立实验：

一次是在样品和运行缓冲液中不加入竞争分子（用于正常结合水平筛选）
另一次是在样品和运行缓冲液中加入竞争分子。竞争分子的作用是抑制化合物的响应信号

图4：(左)1st run, without competitor。（右）2nd run, with competitor

如图4的案例中，阳性对照（Positive control）被完全抑制，阈值（cut-off）基于阴性对照的平均响应值+30 倍标准差（SD）来确定，即使活性结合位点被阻断，片段12和55的响应仍高于阈值水平。

基于Dual injection的竞争实验设计

Dual injection是将两种溶液依次连续注入，无缓冲液间隔步骤，因此在第二针样品上样前第一针样品的解离程度将被最小化（图5），该方法适用于Biacore 1 Series/Biacore 8 Series/Biacore T200/Biacore S200。

图5：Dual injection的竞争实验设计图

如您使用的机型为Biacore T200，方法设置如下图所示：

Biacore T200 control software _File_Open/New method_Biacore method_打开任意方法（例如Single-cycle kinetics）_Cycle type_General_Insert（绿色按钮）_Dual。

如您使用的机型为Biacore 1 Series或Biacore 8 Series，该方法设置如下图所示：

Biacore insight control software_打开任意方法（例如Multi-cycle kinetics/affinity）_Add command_Dual。

2025年，腾讯人工智能生命科学实验室在Nature Communications上发表题为“De novo design of epitope-specific antibodies via a structure-driven computational workflow”的研究论文，提出了一个高通量的计算工作流程tFold System。

通过该系统，作者从头设计了针对四种具有治疗意义的抗原的单克隆抗体，在噬菌体展示技术实现高通量筛选后，利用Biacore进行实验验证，结果表明所设计的抗体表现出纳摩尔级的结合亲和力，并能精准识别特定表位，充分证明了这一集成计算与实验流程的有效性。

其中不仅使用Biacore检测了设计的抗体与其抗原的亲和力/动力学，还对tFold System设计的针对抗原不同表位的抗体的竞争情况进行了验证，其实验方案即为Dual injection。

以作者设计的PD-1抗体为例，共进行四组实验，使用NTA芯片先捕获抗原PD-1，然后用Dual依次进样两种溶液：（1-红色）PD-L1+PD-1抗体和PD-L1；（2-黄色）缓冲液+PD-1抗体；（3-蓝色）PD-L1+PD-L1；（4-橙色）缓冲液+缓冲液。

结果表明，抗PD-1-H965仅在PD-1存在时表现出强结合能力，但在PD-L1存在下其响应值显著降低，证明其与PD-L1竞争结合PD-1（图6左）。同样地，抗PD-L1-H635仅对PD-L1表现出较强的结合能力，当PD-1存在时，其响应值明显下降，证明其与PD-1竞争PD-L1结合（图6右）。

图6：使用Dual injection完成不同抗体与抗原的表位分析实验

基于A-B-A injection的竞争实验设计

A-B-A injection是指通过在样品前后注入SolutionA溶液，在不改变running buffer的条件下，改变分子结合的缓冲条件。使用ABA进样检测竞争性结合时，实验组为在SolutionA和Solution B中均加入竞争分子，对照组则不加竞争分子（图7）。该方法适用于Biacore 1 Series/Biacore 8 Series/Biacore S200。

图7：A-B-A injection的竞争实验设计图

如您使用的机型为Biacore 1 Series或Biacore 8 Series，方法设置如下：

Biacore insight control software_打开任意方法（例如Multi-cycle kinetics/affinity）_Add command_A-B-A；或使用预设方法Assay development_Buffer scouting using A-B-A。

如您使用的机型为Biacore S200，方法设置如下图所示：

Biacore S200 control software _打开任意方法（例如Kinetics multi-cycle）_Cycle type_Smple_A-B-A；或使用预设方法。Biacore S200 control software_Assay development_Buffer scouting using ABA-inject。

2025年，英国学者发表题为“High-Throughput Identification and Characterization of LptDE-Binding Bicycle Peptides Using Phage Display and Cryo-EM”的研究论文，对负责LPS输送的膜蛋白LptDE可结合的双环肽进行高通量鉴定与表征。其中就使用Biacore进行了双环肽的筛选，表征以及表位分析（图8）。

图8：筛选级联过程概览及SPR检测结果示意图

其中表位分析实验设计即为A-B-A injection的方式，先将分子A（5 μM）注入配体表面，再注入分子B（5 μM），以检测分子A的存在是否降低了分子B的结合响应值（图9）。分子B响应值的变化（RB）= 分子B注射时的结合响应值 − 分子B注射前的响应值。在注入分子A后测得的RB值小于仅缓冲液对照组中注入后RB值的80%，则被判定为“有竞争”；否则判定为“非竞争”。

图9：Biacore A-B-A injection竞争实验设计示意图

此外，表位分组是基于竞争性结合的拓展，Biacore Insight software中预设了基于预混法，串联法（using dual），夹心法（using dual）的实验和数据分析模块，相关实验设计细节可参考：

综上，Biacore竞争实验通过灵活多样的设计策略，为不同的应用场景和不同类型的分子竞争研究均提供了高效、可靠的解决方案。

从经典的Sample mix与Buffer mix，到进阶的Dual与A-B-A injection，不同方法各具优势、各有适用场景。合理选择实验方案，不仅能够提升数据解析的准确性，也有助于更深入地理解分子作用机制。

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