MabSelect VL之于双抗纯化的机理浅析

4 月 1, 2026

以Cytiva MabSelect VL为代表的Protein L填料，针对差异主要位于Fab区的复杂抗体（如双抗、三抗）及其相关杂质，可能展现出优于Protein A的选择性^【1-3】，从而降低精纯步骤压力，提高整体工艺稳健性。

本期，智荟专线将依次为大家介绍Protein L亲和原理、影响因素，用于双抗副产物杂质去除的机理研究及经典案例。

Protein L简介

1988年

1988年，L Björck^【4】首次在厌氧菌-大消化链球菌（Peptostreptococcus magnus. 312菌株）中分离到细胞壁锚定蛋白Protein L，发现其与抗体的轻链（命名中的L即Light chain）而非重链发生结合，并在后续展开系列研究^【5】，其全长基因编码719个氨基酸，N端的5个同源重复单元（B1-B5，每个结构域72-76 aa）负责与抗体结合，如图1，选择性结合人抗体κ轻链的1、3、4亚型^{【6，7，8】}，具有多种属结合特征^【9】。Protein L的表达水平与消化链球菌的致病力呈正相关（即表达越高，毒力越强）^{【10，11，12】}。

图1：Protein L分子结构示意图。从左-右：疏水信号肽序列S、N末端序列A、重复的5个和抗体互作区B1-B5、间隔区S、未知功能区C1和C2、细胞壁锚定区W以及疏水跨膜区M【6】

2001年

Graille M等使用另一菌株（3316）的Protein L单个结构域 C*（61 aa，与B4有82.4%同源性）和人Fab 2A2（PDB code: 1DEE）进行晶体结构解析，结果显示单个C*结构域包含四股反向平行β折叠（1-4）和一段几乎与之平行的α-helix，拥有两个独立的Fab结合位点：β2-alpha helix（左侧）及β3-alpha helix（右侧），如图2，且前者的亲和力显著更强成为主导【13，14】，其主要通过与抗体VL κ框架区的主链形成连续的“β拉链“互锁来实现结合，并远离抗原互作的CDR区【13】。

IgM Fab 2A2与Protein L结构域C*形成复合物的带状示意图。Protein L 3316的domain C *（中间大红色）位于两个 Fab（蓝色和绿色）之间，浅色表示轻链，深色表示重链。上方洋红色标示了按照 Chothia定义的 CDR 环，并显示了 Fab–Protein L 互作界面远离抗原结合位点（combining site）【13】。

图2：IgM Fab 2A2与Protein L结构域C*形成复合物的带状示意图。Protein L 3316的domain C *（中间大红色）位于两个 Fab（蓝色和绿色）之间，浅色表示轻链，深色表示重链。上方洋红色标示了按照 Chothia定义的 CDR 环，并显示了 Fab–Protein L 互作界面远离抗原结合位点（combining site）【13】。

由此，也揭示了Protein L和抗体互作原理^【13】：

氢键搭建起互作基本结构框架并精确识别（对齐），驱动互作^【15】；与疏水作用力（熵驱动）^【16】共同成为维持亲和作用的主力；
盐桥（静电互作）也有助于特异性识别及结构稳定，但非主要作用力。

Protein L 互作影响因素

Protein L和kappa轻链的结合强度主要受到PH、电导以及添加剂的影响。

pH：

低pH条件下，Protein L和抗体上的氨基酸残基质子化而带正电，产生静电互斥，促进洗脱【5，13，15】；优化为相对更高pH条件下的洗脱，利于提高纯度【17，18】，并减少低pH敏感样品的聚集体含量。

离子强度：

即缓冲液的整体电导强度，包括buffer体系、盐和添加剂。在一定范围内提高电导（如50-100 mM NaCl或添加剂），结合更强，分辨率也更高；降低电导结合相对更弱，促进洗脱，可用于提高淋洗除杂或洗脱的pH，对低pH敏感样品有利；降低上样量，趋势更加明显^{【19，20，21】}。

如图3，Capto L填料上某非对称型WuXiBody的洗脱pH，随着电导强度的升高而降低，在50 mM 柠檬酸的高电导条件下（黑色线），具有最佳分辨率，前后两段峰中聚体含量分别为16%和35%，并用于后续step梯度优化^【20】。此外，也可以在适当的低pH条件下仅拉NaCl梯度分别洗脱样品和杂质（见后续案例）^【19】。

Capto L填料纯化某非对称型WuXiBody层析图谱。三种颜色分别对应不同电导的洗脱缓冲液50/20/10 mM柠檬酸，拉pH 4.5-2.5线性梯度。上样量 2 mg/mL填料，Tricorn 5/150，BH=15.6 cm，CV=3 mL。(为方便阅读，在层析结果图左侧放分子结构示意图，下同)【20】。

图3：Capto L填料纯化某非对称型WuXiBody层析图谱。三种颜色分别对应不同电导的洗脱缓冲液50/20/10 mM柠檬酸，拉pH 4.5-2.5线性梯度。上样量 2 mg/mL填料，Tricorn 5/150，BH=15.6 cm，CV=3 mL。(为方便阅读，在层析结果图左侧放分子结构示意图，下同)【20】。

洗脱液的缓冲体系选择以及浓度（电导强度）会显著影响分辨率和洗脱的pH值：

不同buffer体系产生的电导强度有差异，通常柠檬酸（三元弱酸）的电导强度大于醋酸（一元弱酸），因此分辨率也更佳^{【17，22】}；
同一buffer体系的电导值越低，洗脱pH相对越高^{【19，20】}。
如图4，Cytiva MabSelect VL常规洗脱条件为50 mM 柠檬酸盐（citrate），pH 2.5 – 3.0，经过buffer筛选，50 mM丙酸盐（propionate）和15 mM琥珀酸盐（succinate）可以将洗脱pH提高到4.3-4.4；通过降低柠檬酸浓度也可以适当提高洗脱pH^{【18，20】}。

图4：不同的缓冲液体系（单羧酸、二羧酸和三羧酸）及浓度（电导强度），对MabSelect VL洗脱pH的影响。样品：trastuzumab单抗，上样量5 mg/mL填料，拉线性梯度 pH 5.0 – 3.0【18】。

添加剂：

根据Hofmeister系列中离子的盐溶效应大小选择盐添加剂、或PEG等多元醇聚合物及混合配方，可以不同程度改变样品和经典Protein A亲和填料之间的互作强度，利于提高洗脱分辨率或优化淋洗条件，如CaCl₂^{【23，24】}、精氨酸^{【25，26】}和NaCl^{【23，27】}，前两者为促进洗脱，NaCl为促进结合。与此不同，2020年，Chen SW等使用串联scFv双抗研究了盐添加剂对Protein L层析的影响，三种添加剂NaCl、CaCl₂和精氨酸均表现为“促进结合”的作用^【21】，究其机理：

电导，主要影响静电互作：

盐添加剂的浓度越高，电导越高，溶液中大量带负电荷的离子（如Cl-）屏蔽了样品和Protein L配基上的正电荷，减弱了静电排斥作用，从而增强结合、抑制洗脱。一定范围内，提高电导，分辨率更高；电导过高，则低收率^{【26，28】}。NaCl和CaCl₂对氢键无影响，因此明显表现为促进结合。

氢键等其他作用力：

精氨酸作为阳离子添加剂，同样可以通过电荷屏蔽作用促进结合。但同时，精氨酸通过质子化的胍基和羧基与Protein L之间形成氢键，和抗体竞争 Protein L 的结合位点，并通过阳离子-π 键以及减弱疏水互作，进一步削弱蛋白和配基之间的结合^{【15，29，30】}。在Chen SW等的研究中发现，精氨酸整体促进双抗与Protein L的结合，但因其同样可以减弱结合作用，更易于达到最佳平衡点，因此精氨酸（~100 mM）对聚集体的去除效果优于NaCl和CaCl₂；且获得同样纯度的条件下，添加浓度最低^【21】。推测上述精氨酸影响到的作用力（氢键、疏水），均参与到Protein L与抗体的互作中，和Protein A以疏水作用为主导有差异。2024年，WuXi Biologics的Qu J等同样针对NaCl、CaCl₂和精氨酸对MabSelect VL resin洗脱的影响进行研究，使用人IgG1抗体得到相似结论^【15】，并推测精氨酸还可能通过形成Clusters^【31】桥接抗体和配基互作，进一步促进了结合。

上述添加剂对分辨率的提高，主要是因为其对于多结合价态的聚集体的结合促进作用比单体更强，进一步放大了二者和填料配基之间的亲和力差异，从而实现分离^{【21，32，33】}。且离子浓度越高，效应越强，如CaCl₂效应是NaCl的2倍^【21】。添加剂可能显著提高分辨率，尤其对于挑战项目，值得筛选。

新一代MabSelect VL简介

2022年，Cytiva上市新一代MabSelect VL亲和层析填料， 选择天然蛋白5个Protein L结合结构域（B1~B5）中的一个进行点突变以优化耐碱性，并多聚化为5个结构域。相比于Capto L，具有更高的DBC载量、耐碱清洗（0.1 M NaOH）、洗脱pH可通过buffer和盐浓度进行优化^【18】以及适配抗体大分子的高刚性骨架，进一步提升并拓宽了Protein L在工业级抗体分子亲和捕获领域的应用。

图5：Cytiva MabSelect VL亲和填料配基结构示意图

Protein L去除双抗杂质机理

参考WuXi Biologics的Li Y.老师发表的综述，Protein L对于双抗副产物杂质去除的机理主要有两点^【32】：

亲和力（Affinity）差异： 基于双抗分子不同亲本抗体与Protein L的亲和力差异，和序列有关^【34】，影响如homodimer、半抗的去除效果。
结合价（Valency）差异：例如对于2条轻链均为kappa 1/3/4型双抗，与Protein L为二价结合；但是副产物杂质半抗、3/4抗体（LC-missing species）则为单价结合^{【22，35】}。同时需考虑分子量差异的影响，相同结合价，分子量越低，亲和力相对越强^【17】。聚集体在排除空间位阻的影响下，结合位点更多。

结合强度Affinity的差异：

Protein L去除homodimer的发现

对于非对称型IgG-like双抗，容易因重组产生与母本单抗类似的同源错配 homodimer，且理化性质相似，最为难去^【36】。尤其当两侧亲本均为Kappa轻链（后续省略1/3/4型描述），homodimer和目标双抗与Protein L的结合位点个数相同，更具挑战。但因序列有差异，可能存在结合强度差别。

2020年，WuXi Biologics的Chen X等发表文章验证Protein L对于不同单抗序列存在亲和力差异。使用Cytiva Capto L纯化四个单抗分子（mab 1~ 4），洗脱pH有显著差异，如图6，提示不同单抗和填料的结合强度有差别。因此，推测可尝试用于分离双抗及homodimer（相当于其来源的单抗分子）^【34】。

使用Cytiva Capto L纯化四个单抗分子（mab 1/2/3/4），层析柱直径0.5 cm、高度15 cm，柱体积~3 mL。样品澄清后上柱，上样量2 mg/mL填料，RT=5 min。拉pH线性梯度洗脱（20 mM citrate, pH 5.0-2.5， 30 CV）。4个单抗分子在Protein L上洗脱pH有明显差异。【34】

图6：使用Cytiva Capto L纯化四个单抗分子（mab 1/2/3/4），层析柱直径0.5 cm、高度15 cm，柱体积~3 mL。样品澄清后上柱，上样量2 mg/mL填料，RT=5 min。拉pH线性梯度洗脱（20 mM citrate, pH 5.0-2.5， 30 CV）。4个单抗分子在Protein L上洗脱pH有明显差异。【34】

KAPPA-KAPPA型双抗的HOMODIMER去除

后续实验表明^【34】，Capto L对于KiH非对称型双抗（两条轻链均为kappa型）以及对应的两种homodimer（knob-knob、hole-hole，前者因空间位阻通常更少）的洗脱保留时间有明显差异，证实亲和力不同。为了模拟真实场景下双抗纯化，作者将上述样品混合，即80% KiH BsAb + 10% knob-knob + 10% hole-hole homodimer，上Capto L柱后，确认实现了有效分离，如图7。另外，原文还验证了Protein L对于去除Fab x scFv （KiH）双抗产生的homodimer同样有效。

Capto L纯化非对称型KiH双抗（80%）以及掺入的两种homodimer（每种10%）层析结果图。上样量1 mg/mL填料。线性pH梯度洗脱（20 mM citrate, pH 5.0-2.5，30 CV）。洗脱峰1：半抗，峰2：knob-knob（结合更弱），峰3：单体主峰；峰4：hole-hole homodimer（结合更强）。 (Inset: 非还原SDS-PAGE胶. M: 蛋白marker; L: 起始样品; Lanes 1–4: 分别为洗脱收集组分1–4。下同）

图7：Capto L纯化非对称型KiH双抗（80%）以及掺入的两种homodimer（每种10%）层析结果图。上样量1 mg/mL填料。线性pH梯度洗脱（20 mM citrate, pH 5.0-2.5，30 CV）。洗脱峰1：半抗，峰2：knob-knob（结合更弱），峰3：单体主峰；峰4：hole-hole homodimer（结合更强）。 (Inset: 非还原SDS-PAGE胶. M: 蛋白marker; L: 起始样品; Lanes 1–4: 分别为洗脱收集组分1–4。下同）

通常，如果非对称型双抗分子来源的两个亲本抗体（parental mAbs）与Protein L的亲和力存在明显差异，更利于从目标双抗中去除过表达产生的任一单侧homdimer（比双抗结合更强或更弱）^{【34，37】}；否则难以分离^【35】。但如何评估不同抗体分子对于Protein L的亲和力，尚未可知，建议就样品单独测试^【34】。

结合价（VALENCY）的差异：

除了前述不同抗体序列存在结合强弱的差异，因样品组成结构差异造成和Protein L互作位点个数即结合价的差别同样影响结合强度。此外，还要考虑互作区域的暴露程度，包括蛋白高级结构折叠以及分子量大小。在具备相同结合位点的前提下，分子量越低，亲和力越高，如同样结合价的轻链强于半抗、3/4抗体或半抗强于全抗^{【1，17，35】}。推测在相同结合位点个数时，低分子量相对高分子量蛋白，表面容易暴露出更多与配基互作的区域，因此亲和力更强^【17】。

KAPPA-LAMBDA型双抗的HOMODIMER去除

对于kappa-lambda非对称型IgG-like双抗，比kappa-kappa型双抗更简单。不结合的lambda-lambda homodimer直接穿透，目标双抗（单价结合）和kappa-kappa homodimer（双价结合）在pH或盐梯度条件下先后洗脱。

PH梯度洗脱法去除HOMODIMER：

针对某kappa-lambda型HER2/PD-1双抗，使用MabSelect VL捕获，不结合的Lambda-lambda homodimer直接穿透，通过拉pH线性梯度（如50 mM citrate，pH 5-2.5），目标双抗先洗脱，结合价更高的kappa-kappa homodimer后洗脱或strip去除；可继续优化为step梯度并线性放大，如图8^【3】。

MabSelect VL装填HiScreen柱并用于step梯度洗脱双抗的层析图谱。从线性pH梯度（50 mM citrate，pH 5-2.5）优化来的step pH梯度（50 mM citrate buffer，pH 3.5和3.1），依次洗脱kappa-lambda异源二聚体双抗、Kappa homodimer。案例中的双抗由trastuzumab kappa 1型anti-HER2轻链、avelumab lambda 2型 anti-PDL1轻链以及anti-HER2重链组成。

图8. MabSelect VL装填HiScreen柱并用于step梯度洗脱双抗的层析图谱。从线性pH梯度（50 mM citrate，pH 5-2.5）优化来的step pH梯度（50 mM citrate buffer，pH 3.5和3.1），依次洗脱kappa-lambda异源二聚体双抗、Kappa homodimer。案例中的双抗由trastuzumab kappa 1型anti-HER2轻链、avelumab lambda 2型 anti-PDL1轻链以及anti-HER2重链组成。

电导率洗脱法去除HOMODIMER：

为了进一步优化在不同结合价背景下，双抗及副产物杂质（如homodimer、聚集体）的分离效率，2019年Chen C等首次尝试在低pH条件下拉电导梯度进行杂质分离，成为经典^【19】。受到Protein L晶体结构以及互作机理（疏水、氢键）的启发，作者考虑是否可以通过调节填料配基和抗体的亲和力，优化杂质去除效果；选择了能引起轻度变构（mildly chaotropic）的NaCl，通过仅调整电导看对洗脱的影响。

实验中，选择Ab#1双抗（κ-λ型，单价结合Protein L）和Ab#2单抗（κ-κ型，双价结合Protein L，模拟κ-κ homodimer），测试在4种单一pH条件2.4、2.7、3、3.3下，分别拉电导梯度（100 – 0 mM NaCl）洗脱，结果显示pH 2.7和3.0分离效果最好，且洗脱pH越低，出峰电导越高，如图9。后续优化为step电导梯度，CIEX-HPLC显示pH 2.7和3.0对应的目的双抗洗脱峰1的纯度分别为92.0%和94.8%。由此，作者将酸性（单一）pH条件下通过控制电导进行样品洗脱的方法命名为“电导率洗脱法（conductivity elution）”，并在后续众多Protein L层析实验中被采用。

图9：左侧：Ab#1双抗（κ-λ型，单价结合Protein L），Ab#2单抗（κ-κ型，双价结合Protein L，模拟κ-κ homodimer）。右侧：pH 分别为2.4、2.7、3、3.3条件下，拉NaCl线性梯度（100 mM-0 mM）洗脱Ab#1和Ab#2，体现出不同分辨率。

半抗的去除

双抗由于单侧序列过表达以及抑制homodimer的技术应用，容易产生半抗杂质^【38】。实际上，Capto L等片段亲和填料对于非对称型（kappa-kappa）双抗中半抗的去除，很大程度上，依赖于亲本抗体的结合强弱，类似kappa-kappa homodimer，而不仅仅是结合价。考虑到分子量小的抗体结合更紧密，亲和力更高，2022年，WuXi Biologics的 Wei Chen等发表文章并假定：样品在Protein L上的洗脱保留时间取决于“（所有位点的结合强度总和）/（分子量）”，公式中的分子部分是由“结合强度”和“结合位点个数”共同决定的。因此，当两侧亲本之间的结合差异足够大，则目标双抗（双价结合）的结合强度，介于两侧的半抗（单价结合，但分子量也减半）之间。如图10，该文献案例中，拉pH线性梯度，结合更弱的knob半抗先洗脱，WuXiBody双抗后洗脱^【35】。

图10：使用Capto L填料分离某非对称型WuXiBody和Knob（kappa型）半抗杂质，二者以质量比为9：1混合。上样量2 mg/mL，RT=5 min，拉线性pH梯度20 mM citrate, pH 5-2.5。

对于两侧轻链分别为kappa和lambda型的双抗，其半抗的去除则相对更简单，主要依赖于结合价和分子量的差异。

Capto L去除3/4抗体

3/4抗体在经典的CrossMabs以及WuXiBody中均有发现，推测由于CH1/CL工程化改造使得部分Fab不稳定而丢失LC【22，39】。3/4抗体在理化性质上和完整双抗非常相似，也使得常规精纯（如离子交换）面临挑战，需要尝试多模式填料如Cytiva MMC ImpRes【40】。

2020年，WuXi Biologics的Y. Wang等实验证实，Capto L可以有效去除非对称型WuXiBody工艺中的3/4抗体【22】。工艺开发过程中，作者通过拉pH线性梯度优化Wash 3的淋洗条件，去除3/4抗体杂质。选用分辨率更高的柠檬酸作为缓冲体系（20 mM citrate, pH 3.8）。注意淋洗pH的优化，尤其对于在低pH条件下不稳定的双抗分子，易形成聚集体。对此，作者增加了一步高pH（5.0/5.5/6.0）淋洗Wash 4重新稳定抗体分子结构后再洗脱，将聚体含量降低到13.5%（降低了~10%），但仍比Protein A高出3%【20，22】。洗脱阶段则选择电导更低、比柠檬酸洗脱pH更高的醋酸作为缓冲体系（50 mM NaAc-HAc, pH 3.2）。后续研究中，作者继续将Wash 3优化为降低电导下的更高pH条件淋洗（10 mM citrate, pH 3.9），去除3/4抗体的同时，进一步减少了3%的聚体，如表1和图11【20】。

表1：使用Capto L纯化某低pH敏感WuXiBody双抗（低pH下易形成聚体）

使用Capto L去除某WuXiBody中3/4抗体的层析结果图。上样量10 mg/mL填料，RT=5 min。旧和新的方法中UV吸收值分别标记为浅蓝和深蓝色，pH分别为浅黄和深橘色。通过Wash 3去除结合的3/4抗体杂质，旧方法为20 mM citrate, pH 3.8，新方法优化为降低电导下的更高pH淋洗（10 mM citrate, pH 3.9），进一步降低了3%的聚集体。

图11：使用Capto L去除某WuXiBody中3/4抗体的层析结果图。上样量10 mg/mL填料，RT=5 min。旧和新的方法中UV吸收值分别标记为浅蓝和深蓝色，pH分别为浅黄和深橘色。通过Wash 3去除结合的3/4抗体杂质，旧方法为20 mM citrate, pH 3.8，新方法优化为降低电导下的更高pH淋洗（10 mM citrate, pH 3.9），进一步降低了3%的聚集体。

聚集体的去除

假设和Protein L的互作序列没有被遮蔽，聚集体和Protein L通常为多价结合【19，21】，从而在传统pH梯度洗脱过程中和单价/双价结合的双抗有效分离【1，20】。此外，在洗脱buffer中加盐效果更佳【21】。

NaCl线性梯度洗脱：

非IgG样双特异性抗体（不含Fc区），更容易形成聚集体【41，42】，在前述Chen C等发表的“电导率洗脱”法文章中，针对双特异性 T 细胞衔接器（BiTEs）双抗分子，通过在低pH条件下，仅拉NaCl梯度（100-0 mM）成功分离了双抗单体分子和聚集体【19】，如图12。

图12：BiTEs抗体分子（两个scFv形成的融合蛋白，文中为样品Ab#3），使用Protein L亲和填料通过在NaAc pH 2.7条件下，拉NaCl 线性梯度100-0 mM，有效分离单体（洗脱峰1，9.59 mS/cm）和聚集体（洗脱峰2，3.80 mS/cm）。

硫酸铵作为添加剂：

除了NaCl，也可以尝试其他盐添加剂如硫酸铵。2024年WuXi Biologics的Dong W等，使用MabSelect VL开发双抗纯化两步法工艺，针对主要杂质为聚集体（含量高达23.3%）的某对称型双抗分子A，在pH step梯度洗脱过程中，于洗脱液中加入硫酸铵（AS），可以进一步优化单体和聚集体的分离效果【43】，这可能与硫酸钠促进单体和聚集体与填料之间不同程度的疏水互作相关。但需注意，更高浓度的AS提高纯度的同时会损失部分收率，建议进行浓度筛选，如表2。文中经小柱测试后，选择了向淋洗和洗脱buffer中添加 5mM AS，从2.9 mL成功放大到106.2 mL（SEC-HPLC 纯度92.0%）。

针对MabSelect VL Wash 2及elution buffer中硫酸铵浓度进行优化，分别添加4/5/6 mM 硫酸铵（第二列），即对应洗脱buffer配方为20 mM NaOAc‑HOAc, 4/5/6 mM (NH4)2SO4, pH 3.4。分别得到monomer纯度范围在89.8–91.9%之间（SEC-HPLC%），与Protein A亲和洗脱的单体纯度（79.8%）相比，有显著提高。上样量30 mg/mL填料（MabSelect VL载量显著提升）。

表2：针对MabSelect VL Wash 2及elution buffer中硫酸铵浓度进行优化，分别添加4/5/6 mM 硫酸铵（第二列），即对应洗脱buffer配方为20 mM NaOAc‑HOAc, 4/5/6 mM (NH4)2SO4, pH 3.4。分别得到monomer纯度范围在89.8–91.9%之间（SEC-HPLC%），与Protein A亲和洗脱的单体纯度（79.8%）相比，有显著提高。上样量30 mg/mL填料（MabSelect VL载量显著提升）。

填料筛选

总之，当拿到一个新的双抗/多抗分子，可以通过计算填料配基的结合位点个数并参考分子量大小，评估不同填料的杂质去除效果。

2025年7月，Nattha Ingavat等发表文章，再次验证了Protein L去除非对称型IgG-like双抗产品相关杂质的有效性【17】。通过评估faricimab双抗与潜在杂质分子与不同抗体亲和填料的亲和力差异，发现Protein L填料的差异最大（不结合的杂质种类也更多），如下图13。后续层析验证，拉pH 6-2.5梯度洗脱，只有Protein L出现三个洗脱峰，且从SDS-PAGE胶图上，体现出更好的对于homodimer、部分3/4抗体、部分heavy-heavy chain、半抗以及部分轻链的去除效率；后续优化为step梯度并成功放大，收率86%、纯度73%（起始HCCF纯度30%)。

图13：左图为faricimab分子结构，靶点VEGF-A和Ang-2，采用CH1-CL CrossMab和KiH技术（Hx和Lx为crossed重链和轻链）。右图为评估不同亲和填料对faricimab双抗及杂质的去除能力差异。

一个Tips：

此外，由于杂质间还存在多种非共价互作，造成原本不结合的杂质被共同洗脱下来，如重链二聚体和轻链二聚体形成的错配复合物^{【17，44，45】}，如图14。加上其它错配（如3/4抗体、homodimer）的发生，也提示通过HPLC-SEC看分子大小之外，非还原SDS-PAGE、LC-MS、分析色谱等进行身份确认也是双抗检测的必要手段^{【17，18，28，37，45】}。