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询价玩转UNICORN｜多步串联一键搞定！
生物分子的纯化通常涉及多个层析步骤，同时每个层析步骤之间往往需要各种中间处理过程，如换液、再上样等，这些过程往往需要手动操作，重复性强但非常耗时耗力，且容易出现人为误差和样品损失。
为了简化和加速下游蛋白纯化过程，可使用全自动多步纯化方案更灵活更高效的提升实验室蛋白纯化效率。ÄKTA go、ÄKTA pure 和 ÄKTA avant可以通过个性化定制配置实现Peak to Loop模式和Tandem模式的多步串联纯化。
今天就为大家详细介绍一下，UNICORN中“Peak to Loop”模式多步串联层析的使用，一键设置，轻松搞定多步层析。
Peak to Loop，意为将第一个层析柱中洗脱的组分暂存在Loop环中，之后再自动进入到第二步的层析柱中。典型应用如：His标签蛋白通过亲和层析进行梯度洗脱，将目标组分暂存在Loop环中之后通过分子筛层析进行精纯，或亲和层析洗脱后直接串联进行洗脱液的脱盐处理等。
今天我们以亲和+分子筛两步串联层析作为案例，分享如何使用UNICORN方法编辑中的模板快速编写多步层析方法：
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首先在Method Editor页面中Method Phases处编写两步层析所用的全部实验阶段，如下图所示。
图1：方法阶段的设置
在Start level输入第一步亲和层析峰收集所需的紫外检测数值起点，End level输入第一步亲和层析峰收集所需的紫外检测数值终点。
勾选Delay start of collection，并设置洗脱延迟一定体积后再启动监测峰收集的功能。考虑到接下来第二步分子筛层析柱对上样体积有一定要求，可根据需求设置第一步洗脱峰的最大收集体积，勾选Max peak volume来输入最大洗脱体积的数值。
最后，还可以在Wash inlet选择清洗Loop环的溶液入口，推荐选择使用第二步分子筛的平衡液如A2。
若您对自动化运行有更高的需求，希望提升多步纯化的实验效率：ÄKTA pure系统也可以对多个不同样品实现连续自动的多步层析方法。
在您的ÄKTA pure层析系统上配置Loop样品环阀搭配软件Scouting序列功能，即可自动化连续实现5个不同样品的“Peak to Loop”多步串联工作。
配置了Loop样品环阀的系统可以在Loop position处选择本次实验存储第一步洗脱峰的Loop环位置（例如图示为1号位）。
在第二步分子筛层析开始前需要设置一个切换第二根柱位的阶段。Pre column pressure和Delta column pressure设置参数需要参考所用分子筛的说明书，下图仅为举例。
图3：方法中切换第二根层析柱位的设置
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接下来继续设置第二步分子筛层析的相关内容。
其中在分子筛的上样Sample Application阶段，选择Loop Injection模式，并在Loop position位置选择上一步亲和洗脱液存储的Loop环位置（例如图示为1号位），在Inlet A 处选择分子筛缓冲液入口如A2，并在Empty loop with处设置利用缓冲液将Loop环存储的第一步洗脱液完整推入柱子上的足量体积。
注意：用于收集亲和洗脱液的Loop环规格建议至少为预期峰洗脱体积的1.3倍以上，也可以使用Superloop超级定量环灵活调整体积。
其他参数按照常规实验工艺参数编写即可。
图4：第二根层析柱进样的设置
设置好该程序后，当您在第一步亲和层析的洗脱阶段的运行过程中，系统会先使用放置在A2入口的清洗溶液进行System Wash，随后对选中的Loop环各做一次正向清洗和反向清洗来做峰收集前的准备（A2推荐使用下一步分子筛层析的缓冲液）。
当系统和Loop环清洗完成后，开始在整个洗脱过程中监控设置的峰收集参数，一旦起峰触发设置的Start level，系统开启“Peak to Loop”功能，会自动收集洗脱峰并通过单独管路流入选中的Loop环存储，直至峰落下触发End level或达到设置的Max volume后，结束第一步洗脱峰收集并存储亲和洗脱峰。
当程序运行到第二步分子筛层析柱上样时，缓冲液会按照程序设置切换柱位，然后自动将第一步存储在Loop环中的亲和洗脱峰注入到第二根分子筛层析柱上实现上样，以达到两步层析串联自动化运行的效果。
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适用型号
由于该功能需要Loop环清洗以及多根层析柱同时连接到层析系统上，因此ÄKTA pure 25系统配置中包含至少一个缓冲液A入口阀（V9-IA或V9-IAB），以及三柱位阀（V9-Cm）或五柱位阀（V9-C）组件时，才可启用Peak to Loop功能。ÄKTA go系统配置中包含三柱位阀（V9-Cm）或五柱位阀（V9-C）组件时，才可启用Peak to Loop功能。
其他型号如ÄKTA pure 150，ÄKTA avant等也可以通过Text编程方法的方式实现多步纯化的自动功能。如您希望进一步了解该功能的应用和方案，可以联系当地Cytiva销售代表或技术支持获取更多内容。
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