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询价玩转UNICORN｜一文学会高效设置全自动多步纯化
生物分子的纯化通常涉及多个层析步骤，同时每个层析步骤之间往往需要各种中间处理过程，如换液、再上样等，这些过程往往需要手动操作，重复性强但非常耗时耗力，且容易出现人为误差和样品损失。
为了简化和加速下游蛋白纯化过程，可使用全自动多步纯化方案更灵活更高效的提升实验室蛋白纯化效率。ÄKTA go、ÄKTA pure和ÄKTA avant可以通过个性化定制配置，依托Peak to Loop+Reinject counted volume功能实现全自动多步串联纯化。
Reinject counted volume
- Manual load是指手动载样至Loop，也就是样品是通过注射器吸取后，手动从Syr口推入Loop中，之后进样阀经过切换至Inject模式，Loop中的样品被Inlet所设定溶液顶入进层析柱中实现上样，溶液顶入的体积由Empty loop with设置。
- Reinject counted volume是指样品已经存入Loop，软件已经通过Start volume count和Stop volume count计算好了存入Loop的样品体积counted volume，之后进样阀经过切换至Inject模式，Loop中的样品被Inlet所设定溶液顶入进层析柱中实现上样，溶液顶入的体积为counted volume。
Reinject counted volume命令通常与Peak to Loop联用，用于以Loop环作为样品暂存过渡的多步层析串联纯化，上一步层析的洗脱样品进入Loop中，洗脱的样品被Start volume count和Stop volume count精确计算，并作为下一步层析的上样体积，成为全自动的多步层析串联方案。
首先在Method Editor页面的Method Phase编写两步层析所用的全部实验阶段步骤，如图1所示：
图1. AC和SEC两步串联层析的方法流程
随后，按照实验工艺参数先编写第一步亲和层析的相关内容。
对于ÄKTA pure 25和ÄKTA go型号的层析系统，可以直接在Elution阶段的收集设置中选择Peak to Loop功能（图2）。
图2.第一步AC层析洗脱Peak to Loop的设置
Start level触发时执行Start volume count，Stop level触发时执行Stop volume count，因此所计算出的count volume就是洗脱峰的体积，同时也是进入Loop环作为第二步层析的样品体积。
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在第二步分子筛层析开始前需要设置一个切换第二根层析柱的阶段Column change（图3）。
除了设置第二根柱子连接柱位的号码之外，需要参考所用分子筛的说明书重新设置Pre column pressure和Delta column pressure参数（图中的参数为举例）。
图3. 切换第二根SEC层析柱位的阶段
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最后设置第二步分子筛层析的相关参数。
如图4所示，在分子筛的上样Sample Application阶段，选择Loop Injection模式，并在Fill loop using中从下拉选项中选择Reinject counted volume，Loop type选择使用的loop类别，如管线loop或者Superloop样品杯，如设备安装了Loop阀则在Loop position位置选择上一步亲和洗脱液存储的Loop环位置，Max volume最大的上样量可设置与连接的Loop环相同的体积，Finalize sample injection设置的是当上完第一步亲和层析洗脱峰的体积之后，再继续顶洗Loop环的溶液体积。在Inlet A处选择分子筛缓冲液入口如A2，其他参数按照常规实验工艺参数编写即可。
图4. 第二步SEC层析柱进样的设置
- 当系统和Loop环清洗完成后，开始在整个洗脱过程中监控设置的峰收集参数，一旦起峰触发设置的Start level，系统开启“Peak to Loop”功能，会自动收集洗脱峰并通过单独管路流入选中的Loop环存储，直至峰落下触发End level或达到设置的Max volume后，结束第一步洗脱峰收集和存储亲和洗脱峰，并且计算出精确的洗脱峰体积同时也是进入Loop环中的体积。
- 当程序运行到第二步分子筛层析柱上样时，缓冲液会按照程序设置切换柱位，然后自动将第一步存储在Loop环中的亲和洗脱峰注入到第二根分子筛层析柱上实现上样。注入体积为上一步计算的洗脱峰体积或者最大为Max volume设置的体积，再加上Finalize sample injection设置的继续用A2溶液顶洗Loop的体积。以达到两步层析串联自动化运行的效果。
适用型号
其他型号如ÄKTA pure 150，ÄKTA avant等也可以通过Text编程方法的方式实现多步纯化的自动功能。
如您希望进一步了解该功能的应用和方案，可以联系当地Cytiva销售代表或技术支持获取更多内容。
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