Easy Biacore系列8 | 遵守药典要求，做好Fc受体检测

8 月 13, 2021

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Fragment crystallizable receptor (FcR)是表达于细胞膜表面并能与抗体Fc结构域结合的受体。与不同的免疫球蛋白结合的受体统称为FcRs，它参与调节和执行抗体介导的免疫反应。一般而言，FcRs连接特定的适应性免疫系统和先天性免疫细胞（肥大细胞、中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞）触发的效应区，进而引发诸多免疫效应，例如：补体依赖的细胞毒效应 (CDC)；抗体依赖的细胞吞噬作用 (ADCP)；抗体依赖细胞介导的细胞毒效应 (ADCC) （图1）。

图1 ADCC效应

对于抗体药物而言，抗体Fc与FcRs的结合，可能引发不同的后果：一方面，可以延长药物半衰期，诱导目的细胞毒效应；另一方面，也存在诱导有害生物学效应的风险。因此，FcRs与抗体药物的检测，一直是表征抗体药物的重点检测项目。

以IgG1单克隆抗体为例，抗体上不同的结构域介导不同的相互作用，包括通过片段抗原结合（Fab）域的抗原结合、Fcγ受体（FcγR）结合、补体成分1q（C1q）结合和新生儿Fc受体（FcRn）结合。除此之外，不同的聚糖可能存在于Fc域中，并对相应结合可能产生影响（图2）。

图2 IgG1单克隆抗体基础结构图

在FcRs中，FcγR亚类主要参与和含Fc治疗药物的相互作用。Fc–FcγR相互作用是复杂的，因为存在多种FcγR亚型，它们对不同人类IgG亚型（IgG1、IgG2、IgG3和IgG4）的Fc具有不同的结合亲和力。表1显示了FcRs与每个IgG亚型的亲和力。总体来看，对于大多数IgG亚型，单体IgG与FcγRI的相互作用具有相对较高的亲和力，而对于其他FcγRs的相互作用具有相对较低的亲和力。

特别注意的是，亲和力测定高度依赖于检测试剂质量、检测方法与实验设计、分析方法等条件。以最新版美国药典为例，在USP1108章节里，详细论述了针对FcRs相关结合分析方法及其注意事项。简单归纳一下，检测数据的质量取决于三大因素：1. FcRs及相应试剂质量 2. 检测方法及实验设计 3.数据分析方法。

FcRs及相应试剂质量

高质量的FcRs及相应试剂是获得高质量检测数据的前提，例如FcRn，为了获得与IgG高效且PH依赖的结合能力，FcRn蛋白应包含FcRn α链的胞外结构域和β-2微球蛋白（β2M）；哺乳动物细胞表达的产品优先推荐，因为其正确的蛋白折叠与翻译后修饰能够最大程度地保证。

检测方法及实验设计

不同的检测方法具有不同的优劣势，但是关键性的检测注意事项包含以下几点：检测方法的灵敏度与检测范围（高灵敏、宽范围优先）；偶联方式、配体选取、偶联密度（低偶联密度是检测的关键，因此检测方法必须具有高灵敏度）；分子间距，空间位阻，亲合力，物质迁移效应和非特异性结合（高偶联是常见诱因之一）；保持分析物浓度稳定（蒸发等效应造成检测浓度不准；大部分Fc–FcγR的亲和力在uM级，这就需要某些检测需要高浓度分析物）；实验条件的设定（Buffer条件的调整，例如PH的调整，Buffer对非特异结合的影响等）。

数据分析方法

对于不能在合理时间内达到结合和解离的稳态平衡，但存在动力学信息的相互作用，通过动力学分析获得ka和kd，进而确定亲和常数KD。当结合和解离的动力学非常快，并且在合理的时间内可以达到稳定状态时，可以使用稳态平衡分析来确定KD，不同拟合模型用于确定相互作用的进一步信息（例如，对1:1结合模型较为常见）。

作为分子互作检测金标准的Biacore SPR方法，无论是在USP1105章节，还是USP1108章节，亦或是2020版的中国药典，都被作为标准方法进行推荐。

正如USP1108章节及中国药典所描述：SPR的方法在Fc相关检测中具有以下优势：非标记技术；检测灵敏度高；更精确的动力学数据；亲和力检测范围更宽；能够自动化制样；数据分析简单明了；可与参考品一起用于表示相对KD数值。正是具有以上检测优势，目前全球已上市抗体药物与FcRs的检测，超过80%都是使用Biacore来进行检测。

参考文献：
USP 2021 https://online.uspnf.com/uspnf/document/1_GUID-8E3807DF-91F5-49DC-B502-18B495CA9B61_2_en-US