Biacore助力贫血症分子诊断与机理研究

镰状细胞贫血症（SCD），是一种遗传性血红蛋白病，因β链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸代替，形成了异常的血红蛋白S（HbS），取代了正常血红蛋白（HbA），当氧分压下降时，血红蛋白S分子之间相互作用，成为螺旋形多聚体，使红细胞扭曲成镰状细胞。镰变的红细胞可发生溶血、堵塞毛细血管等，引起相关症状。

基于分子水平的快速诊断对不同类别的SCD至关重要，能够为最合适的治疗方案提供支持。意大利费拉拉大学生命科学与生物技术学院团队2019年在Sensors & Actuators: B. Chemical期刊发表文章，基于Biacore X100开发了一个简单且可重复的方法对β链突变（βS）进行分子诊断。

研究者首先要筛选检测βS突变的最佳探针（图1A）。分别把两条19-mer生物素标记的寡核苷酸固定在SA芯片上，一条正常，一条含有βS突变。正常19-mer寡核苷酸（βN）偶联1866RU，含βS突变的寡核苷酸（βM）通过target模式达到相近的偶联量。随后，研究者选取了5对不同长度（9-mer，10-mer，11-mer，12-mer，13-mer）的探针进样，评估它们与βN和βM寡核苷酸配对杂交的效率。

从图2传感图可见，9-mer的探针与目标寡核苷酸没有互作，说明长度太短。10-mer和11-mer的探针组合，都能够特异性结合它们的互补序列，但解离很快，说明复合物不稳定。12-mer探针对于互补序列的结合和稳定性都大大提高，出现了非特异性结合（错配），但都解离很快。13-mer探针对于互补序列的结合和稳定性更高，但非特异性结合也大大增强。综合考虑稳定性和特异性，最终选择了12-mer探针组合，分别固定在SA芯片上。

随后，研究者验证固定了12-mer探针的芯片，是否能区分出只有1个核苷酸不同的两段DNA序列。与预期相同，βN探针与正常寡核苷酸结合的响应值和稳定性都高于有突变的寡核苷酸，βM探针与突变寡核苷酸结合的响应值和稳定性都高于正常寡核苷酸。所以12-mer的正常和突变探针能够有效地区分不同的互补序列，可以进一步用于临床样品的βS突变检测（图1B）。

随后，在Biacore的帮助下，研究者优化了用于扩增SCD病人与健康捐赠者的基因组DNA的PCR引物。由图4可以看出，只有第一组引物的PCR产物对于βN和βM探针有特异性的结合。对于βN探针，健康人的PCR产物能高效稳定结合，而不结合βS纯合子的PCR产物， βS杂合子的PCR产物的结合信号居中（由于一条βS等位基因，图4A）。对于βM探针，结果正好相反（图4B）。而第二组、第三组引物的PCR产物对于探针的结合效果较差（图4CDEF）。

至此，所有实验条件优化完毕，研究者分析了53个临床DNA样品：20个健康人（N/N），14个βS杂合子（N/M），19个βS纯合子（M/M）。图5中显示了3个代表性的传感图，健康人（图5A），杂合子携带者（图5B）和纯合子SCD病人（图5C）。

为了进一步定量，研究者通过进样时的响应值（RUfinal – RUinitial），通过βN响应值/βM响应值的公式进行SCD-index的计算。SCD-index大于1的为健康人，介于0和1之间的至少含有一条βS等位基因。

这篇文章中，作者成功的将SPR技术运用于镰状细胞贫血症的临床基因检测，从探针长度筛选（图2）-> 最佳探针验证（图3）-> PCR引物优化（图4）-> 临床样品检测（图5）-> SCD index计算统计（图6）每一步都使用了Biacore。此前该实验室也做了关于β-地中海贫血的SPR基因检测研究，发表了多篇论文（见扩展阅读）。相比原有的方法，这篇文章中的策略更加省钱，只需要1个芯片即可分析多个项目、多个样品，而且实时精准效率地检测单点突变，特别适合产前诊断，也说明SPR生物传感器作为潜在的诊断工具大有前景。

β-地中海贫血是一种遗传性血红蛋白病，由于β球蛋白基因的功能紊乱或缺失，导致溶血性贫血，无效性红细胞生成，和铁超负荷。Erythroferrone（ERFE）是一种新发现的激素，是由核红细胞受促红细胞生成素（EPO）刺激后，分泌的一种糖蛋白类激素，可抑制铁调素的表达，从而增加铁的吸收和动员。β-地中海贫血病人中，促红细胞生成素刺激下的异常ERFE高循环，促进组织中的铁积累，导致这些病人的症状。

2020年，牛津大学MRC Weatherall分子医学研究所团队在Blood期刊发表文章，发现铁调素的表达受到骨形成蛋白BMP/SMAD信号通路的调控。ERFE抑制BMP6，下调肝细胞中BMP/SMAD信号，从而抑制铁调素。随后他们又开发了针对ERFE的N端结构域的抗体，能解除铁调素抑制，减轻小鼠的地中海贫血症状。

为验证ERFE对于BMP/SMAD信号通路的抑制，研究者将人ERFE通过氨基偶联固定在CM4芯片（BR100534）上，将重组蛋白BMP2，BMP4，BMP6，GDF15（阴性对照）对半稀释后进行浓度梯度进样（3.13 – 50 nM），使用10mM Glycine pH1.5进行再生。研究表明ERFE以纳摩尔级的亲和力结合BMP6，以较弱的亲和力结合BMP2和BMP4。随后，研究者开发了针对ERFE的抗体，解除铁调素的抑制，修正β-地中海贫血小鼠模型的铁负荷表型。

综上所述，无论是在镰状细胞贫血症的分子诊断探针的设计与开发，还是在β-地中海贫血症的致病机制及相关治疗药物开发中，Biacore均发挥了重要作用。也为不同类型贫血症的诊断、致病机制及治疗药物开发奠定了基础。

自 1990 年上市至今，Biacore 作为分子互作检测的“金标准”，成功助力基础科研与药物开发的多个研究领域取得重大突破。截至目前，借助 Biacore 累计发表的文章已突破 55,000 篇，超过 80% 的已上市的抗体药物的研发、申报、生产过程中也均有 Biacore 的身影。此外，Biacore 可检测样品的范围十分宽泛，除了常规的蛋白、多肽、抗原、抗体、核酸、有机小分子之外，分子量超高的蛋白复合体、多糖、纳米材料、高分子材料、到完整的细胞、细菌、病毒，甚至临床样品也同样能够检测，并给出漂亮的数据。