在如今后疫情时代的背景下，新冠未去，流感病毒又不时卷土重来。流感病毒由于基因容易发生变异，突变成新的流感病毒变异株，因结合诱发突变带来的耐药性一直困扰着抗病毒新药的发现，急需发展新型抗病毒药物。此外禽流感病毒频繁地从禽类跨物种直接传播感染人类，给人类健康和公共卫生安全埋下了巨大隐患。

Biacore作为分子互作的“金标准”，在新冠病毒入侵机制以及治疗性药物的研究中发挥了重要作用，今天就来看看Biacore在流感病毒的研究中提供了哪些核心数据。

哈尔滨兽医研究所在《PLoS Pathogens》发表的题为 “Selective usage of ANP32 proteins by influenza B virus polymerase: Implications in determination of host range”的文章中，揭示了B型流感病毒 (IBV) 感染的种间限制机制。文章认为病毒RNA聚合酶活性的关键宿主因子——ANP32家族中的ANP32A的物种差异决定了IBV的宿主范围。

禽类ANP32A (chANP32A) 有33个氨基酸序列插入，导致禽类ANP32A无法有效支持IBV的复制（图1A）。然而Co-IP的结果显示chANP32A/huANP32A/huANP32A+33均结合IBV聚合酶（图1B），由于Co-IP无法提供亲和力的定量数据，无法看到亲和力的差异性。

Biacore能够实时记录分子相互作用的全过程，除了得到定性数据之外，还能够得到准确的定量数据。Biacore结果显示，huANP32A、chANP32A与IBV的RNA聚合酶的亲和力有着显著差异（图2A/B），并且插入33个氨基酸的huANP32A+33与聚合酶的亲和力从0.05418 μM减弱至0.1013 μM。Biacore的定量数据有力证明33个氨基酸的插入降低了禽类ANP32A与IBV聚合酶的亲和力，致使禽类无法支持IBV的复制，造成了B型流感病毒感染的种间限制。

中科院微生物所发表多篇文章，解读各种亚型的禽流感病毒的跨种传播机制，文章认为HA受体结合偏好性的转变是流感病毒跨种传播的关键决定因素。研究中用Biacore验证了HA及其突变体与禽源唾液酸受体和人源唾液酸受体的结合亲和力（图3）。虽然不同亚型流感病毒HA跨种传播的分子机制有所差别，但这种演化趋势的阐明对于流感病毒的防控具有重要指导作用。

北京大学在《Journal of Medicinal Chemistry》发表的题为“Discovery of Pentacyclic Triterpenoids as Potential Entry Inhibitors of Influenza Viruses”的文章中，报道了自然界广泛存在的五环三萜类化合物具有抗流感病毒的活性。研究人员首先用Biacore验证了筛选得到的两个先导化合物Q8和Y3与病毒HA的结合，两者的亲和力分别为14 μM和6 μM（图4）。

研究人员猜想Y3是通过阻碍HA与唾液酸受体的结合发挥抗病毒的作用（图5A），在Biacore设计了竞争实验进行验证。实验中将唾液酸受体固定在芯片表面，检测其与HA的亲和力为70 nM，将Y3与HA预混后上样明显降低了两者的亲和力 (KD=844 nM) ，选择的阴性对照Arbidol对两者的结合没有影响，而阳性对照Curcumin表现出与Y3相似的效果。Biacore结果证明Y3/Curcumin显著抑制了HA和唾液酸受体的结合（图5B）。

在此基础之上，研究人员设计并合成了以环糊精为核心骨架，外围缀合多个五环三萜药效团的多价化合物，为具有多价效应的抗流感病毒进入抑制剂的设计提供了新的思路，相关成果发表在《Biomaterials》杂志上。研究中同样用Biacore表征了该药物与靶点的亲和力，并且对其抑制HA与唾液酸受体结合的作用机制进行了验证（图6）。

PROTAC（Proteolysis targeting chimeras，蛋白降解靶向嵌合体）作为近年新型药物的热点，也出现在流感病毒相关药物开发中。在2022年发表的题为“Discovery of Pentacyclic Triterpenoid PROTACs as a Class of Effective Hemagglutinin Protein Degraders”的文章中，就介绍了利用PROTAC定向降解蛋白技术用于流感病毒药物开发的成果。将与流感病毒血凝素蛋白 (HA) 结合的齐墩果酸 (OA) ，分别与CRBN和VHL两种E3连接酶配体连接，实现了在分子和细胞水平对血凝素的降解。实验中用Biacore确认该PROTAC保留了结合VHL连接酶（图7A）以及HA（图7B）的能力。

2022年“世界流感日”的宣传主题是“控制与应对，包容与韧性”，对流感病毒的控制与应对离不开科研工作者的努力，也离不开先进的技术提供核心的数据。Biacore凭借无可比拟的灵敏度、过硬的数据质量，宽广的应用领域持续助力科学进步和药物上市，与科研工作者共同铸就一个健康未来。

五月份出现的猴痘疫情，成为继新冠疫情之后又一公共卫生安全焦点。截止目前，20多个国家和地区出现猴痘疫情，并出现人际传播的现象，这让人不禁担心，世界会不会再次出现类似天花疫情的危险？

作为天花病毒的近亲，猴痘与天花同属正痘病毒属。人类感染猴痘病毒后，临床症状与天花相似，但病情较轻。通过疫苗接种，1980年天花被彻底消灭，而此时的分子生物学处于萌芽期，加之痘病毒疫情又处于偶发、小范围状态，因此，痘病毒研究领域一直处于浅显且沉寂的状态。直到2001年，美国发生的生化恐怖袭击让痘病毒领域再次成为热点，科研界借助Biacore SPR技术，发现了一大批突破性成果。今天，我们将通过五篇高水平文章，与大家一览Biacore在痘病毒研究领域的风采。

该文章的突破性发现：首次发现天花病毒编码的肿瘤坏死因子受体同源物CrmB不仅作为可溶诱饵TNFRs，而且还结合和抑制几种趋化因子。同时首次发现趋化因子结合域，揭示了一类痘病毒分泌趋化因子抑制剂家族。这些研究成果极大地促进了天花病毒的致病机制研究。

关键信息：通过Biacore动力学数据发现，CrmB及CrmB-CRD作为TNF受体可以特异性、高亲和地结合TNF，并且CRD结构域包含足够的结合位点，满足于TNF的结合。

关键信息：通过Biacore 对CrmB和所有43种市售人趋化因子进行筛选和表征。结果发现天花病毒 CrmB和趋化因子相互作用与TNF类似。其中CCL28、CCL25、CXCL12、CXCL13和CXCL14与天花病毒 CrmB具有最佳结合。

关键信息：在Biacore实验中，将TNF和CXCL12单独注射或同时注入，分别检测对应信号，并将单独信号与同时注入信号相比较，结果显示，TNF与CXCL12结合互不影响，表明二者结合位点相互独立。

关键信息：在Biacore实验中，CrmB-CTD结合趋化因子但不结合TNF，而CrmB-CRD结合TNF但不结合趋化因子。结合已有实验数据表明CTD是一种全新的天花病毒编码趋化因子受体结构域。

关键信息：在Biacore实验中，分别检测市售可用的35种趋化因子与三种SCPs的结合，结果显示三者均能与同一组小鼠趋化因子结合。同时，这些SCPs也能与人类趋化因子相结合，这也就意味着SECRET结构域能够识别一类痘病毒分泌的趋化因子抑制剂家族。

该文章的突破性发现：1.确定hIL-18的Leu5、Lys53和Ser55是天花病毒IL-18BP的结合位点。同时，Lys53和Ser55也是hIL-18Rα的结合位点。2.天花病毒IL-18BP通过与hIL-18Rα竞争三个常见残基从而中和hIL-18活性，这有助于开发阻断天花病毒IL-18BP的药物。

关键信息：通过Biacore动力学数据可以看出，K53A、S55A和L5A突变使得亲和力KD分别减弱100倍、7倍和4倍，而其他突变的KD变化都在2倍以内，这充分显示出这三个关键氨基酸在hIL-18结合活性中的重要作用。

关键信息：通过Biacore动力学数据可以看出，E6A突变没有降低hIL-18与hIL-18Rα的亲和力，但K53A和S55A突变将亲和力分别降低了4倍和2倍以上，表明Lys53，Ser55也是hIL-18Rα结合位点的一部分。

该文章的突破性发现：1.通过创新性视角，以蛋白与DNA互作为切入点，发现痘病毒五大类Zα结构域与Z-DNA的结合活性。2.通过圆二色谱法发现ZαE3L将B-DNA转化为Z-DNA的机制。

关键信息：将Z-DNA生物素化后，偶联到SA芯片，随后将各类蛋白作为流动相，使用Biacore检测痘病毒五大类E3L 蛋白Zα结构域与Z-DNA的结合活性。结果显示，痘病毒五大类E3L 蛋白Zα结构域确实与Z-DNA具有结合活性，且结合活性较强。

该文章的突破性发现：1.确认病毒编码的分泌型细胞因子受体与细胞表面表达的糖胺聚糖相互作用及其重要意义。2. 证实控制IFN活性是IFNα/βBP在体内的主要功能。3.IFNα/βBP需要细胞结合活性才能赋予病毒充分的毒力并保持免疫调节活性。

关键信息：已确认IFNα/βBP E194是介导IFNα/βBP与细胞表面糖胺聚糖的关键氨基酸，但是E194是否具有介导IFN结合活性的功能一直是未解之谜。使用Biacore，将各类E194及其突变体偶联到SA芯片，并将IFNα作为流动相，检测获得两者之间的亲和力。通过数据对比，确认E194无介导IFN结合活性的功能。

该文章的突破性发现：1.阐释了痘病毒的种属嗜性，特别是SPICE（天花补体抑制剂酶）与VCP（痘苗病毒补体控制蛋白）在抑制人和牛的替代补体途径（CP）方面表现出选择性。2.确认VCP对牛CP抑制活性完全是由于其增强的辅因子活性，而没有对牛CP C3转化酶衰变产生影响。3.验证了VCP特异性和增强VCP辅因子活性的关键位点。

关键信息：VCP的CFA的增强是导致VCP对牛CP特异性的主要因素，而VCP具有这种活性是因为它与C4b和因子I的相互作用。因此，研究人员使用Biacore将C4（H2O）定位在SA芯片上，将VCP、SPICE或突变体作为流动相，分析其结合情况。结果显示，VCP与SPICE相比，与牛C4（H2O）的结合略有增加，各类突变体显示出与SPICE类似或更低的结合。这表明VCP对C4（H2O）的CFA增强不是由于其与C4（H2O）结合增强造成的。

关键信息：VCP三个关键位点（108, 120, 144）一直是研究的热点，那么以上三个位点是否对于牛CP特异性具有贡献？为了解答这一疑问，研究人员使用Biacore，将各类多突变体与C4（H2O）进行亲和力检测。数据显示，三个关键位点（108, 120, 144）的突变与野生型相比无明显变化。因此，VCP对于牛CP特异性的贡献也与三个关键位点与C4（H2O）结合无关。

洋洋洒洒两千字，只能略显Biacore在痘病毒研究领域的风采，而在全球疫情肆虐的当下，唯实、唯真突破病毒关键致病机制成为目前最紧迫的任务。作为传染病研究领域的利器，Biacore以高效、精准、可靠的性能与科学家们一道，不断探究各类传染病的发病机制，携手研发预防与治疗性药物，最终实现“Biacore，for a better life”的愿景。

肠道病毒（Enterovirus）包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃克病毒及新型肠道病毒，会导致多种人类及哺乳动物疾病，如感冒、手足口病及脊髓灰质炎病等。脊髓灰质炎疫苗预防效果甚佳，但是对其它肠道病毒感染尚缺少特异的控制方法。柯萨奇病毒可通过粪-口途径和口-口途径传播。一般情况下，婴幼儿大多隐性感染；5 岁以下，尤其 3 岁以下儿童，排毒时间可达一个月。病毒感染人体后，可引起上呼吸道感染、急性心肌炎等疾病，对婴幼儿的健康造成严重威胁。在柯萨奇病毒致病机理研究与药物开发中，Biacore 能够大显神威，轻松玩转病毒粒子。

柯萨奇病毒 A10（CV-A10）属于 A 族肠道病毒，作为引发手足口病的相关病原，对全球婴幼儿的健康具有严重威胁。除在患者手、足、口处引起红色疱疹外，CV-A10 的感染还可能导致发热、疱疹性咽峡炎，严重者甚至引发病毒性脑膜炎等。

肠道病毒受体分为介导病毒粘附和脱衣壳两类。2019 年，中科院微生物所高福团队在 Cell 期刊上发表文章，揭示了 B 族肠道病毒通过双受体系统入侵宿主细胞（见扩展阅读）。2020 年，该团队再接再厉，在 PNAS 期刊发表文章，鉴定了含有 Kringle 结构域的跨膜蛋白 1（KRM1）为 A 族肠道病毒入侵细胞的重要受体，并系统地研究了其作用机制以及病毒入侵的过程。

在这篇文章中，研究人员就大量使用 Biacore 检测病毒粒子与相关受体的结合情况。首先，研究人员利用 Biacore 研究了 CV-A10 的成熟病毒粒子与 KRM1 受体在中性（生理条件）及酸性（内吞体条件）环境下的相互作用。CV-A10 成熟病毒粒子通过生物素化修饰，固定在 SA 芯片上，固定量约 6000RU。KRM1 的可溶胞外结构域及其 D90A，W106A，Y165A 突变体使用 PBST 缓冲液进行梯度稀释后，依次进样 1 min，解离 2 min，通过参比通道及 0 浓度进行双扣减保证数据质量。在每次进样后，使用 3M MgCl2 进行芯片表面再生。

实验结果表明，KRM1 胞外区（23-373）在 pH7.4 以高亲和力（KD = 42nM）特异性的结合成熟 CV-A10 病毒粒子（图 1A），而不结合空粒子（图 1B）。结果佐证了 KRM1 是细胞表面介导病毒粘附的受体，且空病毒粒子因不与该受体结合，所以不具有传染性。由于许多肠道病毒通过内吞体途径进入宿主细胞，在酸性条件脱衣壳。研究人员也测试了 pH5.5 条件下 KRM1 与成熟 CV-A10 病毒粒子的结合，虽然相较中性条件亲和力稍稍降低（KD = 210nM），但 KRM1 在酸性环境下也能高效的结合成熟 CV-A10 病毒粒子（图 1C），暗示了 KRM1 也可能在内吞体内作为脱衣壳受体。

随后，研究人员利用冷冻电镜技术，解析了 CV-A10 病毒与 CV-A10/KRM1 复合物在中性和酸性 pH 条件下高分辨电镜结构，揭示了 KRM1 与 CV-A10 病毒结合的分子模式。KRM1 通过其 KR 结构域（黑）与 WSC 结构域（橙）同时与病毒表面 VP1（蓝）、VP2（绿）、VP3（红）发生相互作用，横跨由 VP1 蛋白形成的「峡谷」样结构部位（图 2A），并显示出 KRM1 上 3 个重要的氨基酸位点 D90，W106（图 2E），Y165（图 2F）。

为了验证结构生物学分析结果，研究人员分别将 KRM1 的核心互作残基 D90、W106、Y165 替换为丙氨酸。所有的突变体蛋白在体积排阻色谱（ÄKTA + Superdex 200 Increase 10/300 GL column）纯化中均状态良好（图 3D、E、F）。然而 Biacore 检测结果表明，相较于 WT KRM1，这些突变蛋白对 CV-A10 的亲和力显著降低（图 3 H、I、J），证实了它们在与病毒粒子相互作用中的关键地位。

随后，研究人员进一步通过体外实验，模拟生理环境（37 摄氏度，晚期内吞体酸性 pH），证实 KRM1 能够在酸性条件下介导病毒完成脱衣壳。

KRM1 在 CV-A10 入侵过程中发挥了「一石二鸟」（two in one）的功能，同时介导病毒粘附及脱衣壳两个过程（图 4）。

柯萨奇 B 组病毒（CVB）是可导致多种严重疾病的肠道病毒病原体，可通过粪口等途径传播，传染性强，可感染婴幼儿、青年人及成年人，在全球广泛流行。CVB 可引发重要疾病，包括发热、手足口病、腹泻、脑炎、脑膜炎、心肌炎、胰腺炎、急性弛缓性麻痹等，甚至死亡。CVB 感染与近年来发病率不断上升的病毒性胰腺炎、病毒性心肌炎存在密切联系，是导致 I 型糖尿病和青少年心源性致死的主因之一，具有严重的-危害性。但目前尚无 CVB 特效治疗药物和预防疫苗，相关药物的研发是当前肠道病毒研究的重要方向。

厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心的夏宁邵教授团队在肠道病毒研究领域有多年经验，先后在 Nature Communications 2017（见扩展阅读），Science Advances 2018，Nature Microbiology 2019，Cell Host & Microbe 2020 上发表多篇肠道病毒重要病原体 CVA6、CVA10、EVD68 和 CVA16 的研究论文。今年 2 月，他们又在 Cell Host & Microbe 发表文章，阐明了柯萨奇 B 组病毒（CVB）与其脱衣壳受体（柯萨奇病毒-腺病毒受体，CAR）相互作用及变构过程的精细特征，从分子水平上揭示了 CAR 介导 CVB 病毒高效脱衣壳的作用机制与关键位点，并在此基础上发现了可模拟受体作用特征，诱导 CVB 成熟病毒颗粒失稳及崩解的高效治疗性抗体。

在这篇文章中研究人员使用 CVB1 成熟病毒粒子皮下免疫小鼠，筛选以 CAR 结合位点为目标的单克隆抗体。竞争 ELISA 实验表明，单克隆抗体 5F5 以浓度依赖的方式，有效抑制 CAR 与 CVB1 成熟病毒粒子的结合（图 5A），表明 5F5 的结合位点也许重合或接近 CAR 结合区域。然后，研究人员使用 Biacore 8K 研究了抗体 5F5 与 CVB1 成熟病毒粒子的相互作用。他们使用 ProteinA 芯片捕获抗体，将成熟病毒粒子进行两倍梯度稀释后进样，最后使用 10 mM Glycine pH1.5 进行再生。Biacore 检测结果显示 5F5 以高亲和力（17.9 nM）结合成熟病毒粒子（图 5B）。随后，基于细胞的中和实验进一步证实了 5F5 的高中和活性，对 CVB1 301 毒株 IC50 0.11 μg/mL，对 Conn-5 毒株 IC50 1.49 μg/mL（图 5C）。

在此项研究中，Biacore 8K 提供了关键的亲和力数据，并与 ELISA 以及细胞水平的中和实验结果交叉验证。借助 Biacore 8K 与配套的 ProteinA 芯片能够多快好省地完成大量抗体-抗原（病毒粒子）的相互作用及重复验证实验。此外 Cytiva 新推出的 Biacore Insight Evaluation Software, Concentration and Potency Extension 扩展包（29332204）能帮助用户一次实验即可获得亲和力，动力学，EC50 和 IC50 数据，更加方便、快捷、高效的助力药物开发（图 6）。

参考文献：

中科院微生物所，Molecular basis of Coxsackievirus A10 entry using the two-in-one attachment and uncoating receptor KRM1，Proc Natl Acad Sci U S A. 2020 Aug 4; 117(31): 18711–18718.

厦门大学，Cryo-EM structures reveal the molecular basis of receptor-initiated coxsackievirus uncoating，Cell Host Microbe. 2021 Feb 3;S1931-3128(21)00001-9.

扩展阅读：

南开大学，Serotype specific epitopes identified by neutralizing antibodies underpin immunogenic differences in Enterovirus B，Nat Commun. 2020; 11: 4419.

中科院微生物所，Human Neonatal Fc Receptor Is the Cellular Uncoating Receptor for Enterovirus B，Cell. 2019 May 30; 177(6): 1553–1565.e16.

厦门大学，Atomic structures of Coxsackievirus A6 and its complex with a neutralizing antibody，Nat Commun. 2017 Sep 11;8(1):505.