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“多”用途，“肽”给力——Biacore 在多肽药物开发中的应用

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多肽通常指不超过 100 个氨基酸构成的肽链。多肽药物集合了化学药物和蛋白类药物的优点，如分子量小、免疫原性低、生物活性高等，成为 21 世纪极具发展前途的药物。

目前，已有多款多肽药物获批上市，如胰岛素、生长激素、依特卡肽等。Biacore 作为中美日药典收录的分子互作技术，已广泛应用于多肽药物的筛选、机理研究、长效化、免疫原性和质控放行等环节，为诸多多肽药物开发提供了关键数据。

01. 多肽药物筛选

Biacore 进行多肽药物筛选的原理主要基于动力学数据，其中 ka 反映药物与蛋白的结合快慢，kd 反映药物结合靶标的稳定性，KD 反映药物与蛋白的亲和强弱。Biacore 可以快速精准的对多肽分子进行筛选和排序，从中筛选出亲和力高、解离慢的进行进一步开发。

例如：

北京大学来鲁华教授课题组针对肿瘤坏死因子 TNF-α 进行了多肽设计计算，然后将 TNF-α 固定在传感芯片表面，基于 Biacore 完成了多肽的结合活性测定，最终筛选到了 TBHa31 这一高亲和多肽。

研究人员还基于 Biacore 设计完成了多肽的竞争实验，证实了 TBHa31 可以阻断 TNF-α 和 TNFR 的结合。作者还对 TNF-α 进行了部分位点突变，发现突变后亲和力有明显降低甚至消失，进一步证实 TBHa31 的结合靶点就是 TNF-α。

2019 年，华北理工大学附属医院利用 Biacore 技术完成了降糖多肽的筛选。前期研究发现胃泌酸调节素 OXM 是一个有降糖作用的 37 肽，但其半衰期太短。于是作者设计了一系列的 12 肽 GLP-1 激动剂接到 OXM 上，最终基于 Biacore 结果筛选到了 PP11 作为基础进行脂肪酸链修饰以延长半衰期，并取得了不错的临床效果。

02. 多肽药物机理研究

肿瘤细胞表面特异性高表达的硫酸糖胺聚糖（GAG）与肿瘤细胞转移紧密相关。由神经降压素衍生的多肽家族 (NT4) 具有显著的抑制肿瘤生长效果。细胞影像显示 NT4 多肽能够结合于肿瘤细胞表面，暗示 NT4 作用机制可能与 NT4-GAG 之间的相互作用有关。

为了阐明 NT4 的作用机制，研究人员将 NT4 多肽固定到芯片表面，不同类型的 GAG 聚糖（肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素）依次流过芯片表面进行亲和力测定。

Biacore 结果表明肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素均能与 NT4 直接相互作用，并且亲和力达到 nM 级别，提示 NT4 多肽具有很好的药物开发潜力。同时 NT4 与不同 GAG 之间结合的亲和力相差 1-2 个数量级，具有显著的选择性，这可能是 NT4 针对不同肿瘤治疗效果差异的分子基础。

结合细胞实验数据，研究人员比较了 NT4 对肿瘤细胞的抑制效果。NT4 与 GAG 的亲和力越高，抑制效果越好，当亲和力低至 10-8M 后，无抑制效果。

这篇文章中，Biacore 提供了直接的、定量的分子水平相互作用数据，帮助科研人员确证相互作用的发生机制和对象，与细胞实验结果具有很好的一致性。所以 Biacore 可以作为细胞实验前的高通量药物筛选工具，无需细胞培养，节省大量的时间人力成本。

蛇毒含有丰富的活性肽, 具有抗炎和免疫调节作用，但其抗炎活性成分及作用机理尚未明确。第二军医大学通过噬菌体展示技术从蛇毒中筛选得到了 Hydrostatin-SN1 这一天然多肽，采用 Biacore 阐明了该多肽能够特异性地结合 TNFR1（KD = 32μM），且 Hydrostatin-SN1 能够剂量依赖性阻断 TNF-α 与该受体的结合，从而发挥抗炎作用。

03. 多肽药物长效化

在已上市的多肽药物中，胰岛素和胰岛素类似物占有举足轻重的地位。胰岛素的好坏很大程度上取决于其与胰岛素受体的结合活性，而胰岛素疗效持续的时间长短则依赖于其在受体上解离快慢，因此，精确的表征不同胰岛素候选药物与受体结合的解离速率常数 kd，在胰岛素类药物研发的过程中至关重要。而这正是 Biacore 无可替代的优势所在。

目前，赛诺菲、诺和诺德、甘李、通化东宝等国内外胰岛素生产企业巨头纷纷采用 Biacore 进行胰岛素类似物的开发和质控，涵盖了胰岛素、德谷胰岛素、地特胰岛素、甘精胰岛素等从第一代到第四代全部的胰岛素产品。

半衰期短是多肽药物面临的一大痛点。同济大学开发了一种治疗糖尿病的新型多肽，这种经过改造的 GLP-1 类似物能高亲和地结合白蛋白，免受肾脏滤过和蛋白酶降解，从而有效延长了药物在体内的半衰期。

该设计是在 GLP-1 上通过一个可被凝血酶切割的 linker 连接了由 39 个氨基酸组成的白蛋白结合域，而延长半衰期的关键就是提高多肽与白蛋白之间的亲和力。在此过程中，研究人员用 Biacore 验证了其构建的 XTS1/2 与不同种属的白蛋白之间的亲和力。

结果显示 XTS1 与白蛋白的亲和力高于 XTS2，预测 XTS1 在体内也有更长的存留时间。后续的动物实验也表明，XTS1 比利拉鲁肽有更好的结果。

除了利用与白蛋白的结合延长半衰期外，PEG 化也是一种经典的延长多肽半衰期的方法。但 PEG 的分子量比较高，多肽在 PEG 化后有可能影响其与相应受体的结合。因此，准确检测多肽 PEG 化前后与受体结合活性的变化对于其药效的发挥至关重要。

目前，辉瑞和金赛药业在长效生长激素的开发中，也都使用了 Biacore 去检测 PEG 化前后对生长激素与受体结合的影响。并且该方法已经成为行业内的放行标准，用于不同 PEG 化多肽产品的批次放行。

04. 免疫原性

药物在体内会引起免疫应答，轻则中和药效，重则引起不良反应。免疫原性涉及药物的安全性和有效性，因此 FDA、EMA 等法规均将药物免疫原性列为强制性要求的检测项目。免疫原性包括抗药抗体 (ADA) 的筛选、验证、分型与中和活性检测。

在 2020 中国药典中，已将 Biacore 基于的 SPR 技术列为了免疫原性检测技术。
在 FDA 免疫原性指导原则中，将 SPR 技术与 ELISA、RIPA 一同列为了推荐的三种筛选方法。
在 EMA 对免疫原性检测的指导原则中，详细阐释了 SPR 技术进行免疫原性检测的优势：SPR 是一种实时检测技术，能够检测快速解离的抗药抗体，这些 ADA 可能无法被其他方法检测到，因为 ELISA 基于的桥联法可能会在检测过程中丢失信号，并且 Biacore 也比 ELISA 方法更耐受药物分子干扰。

因此，Amgen 公司的依特卡肽、赛诺菲公司的利西拉肽等上市多肽药物均基于 Biacore 完成了免疫原性数据申报，结果证实了 Biacore 抗药性抗体检出率高的优势。

综上所述：Biacore 作为分子互作检测金标准，已经广泛应用到多肽药物开发的很多环节，助力一大批多肽药物从研发走向上市。而作为唯一被中国、美国、日本药典收录的分子互作检测技术，Biacore 已广泛用于抗体、疫苗、多肽、小分子药物的研发、机理研究、免疫原性、质控放行等各环节，将继续为新药开发护航助力。

参考文献：

1. Angewandte Chemie, 2013, 52(42): 11059-11062.

2. Organic & biomolecular chemistry, 2019, 17(33): 7760-7771.

3. International journal of molecular sciences, 2016, 17(11): 1940.

4. Scientific reports, 2016, 6(1): 27174.

5. Scientific reports, 2016, 6(1): 1-13.

6. RSC Advances, 2019, 9(53): 30707-30714.

7. Xenobiotica, 2008, 38(10): 1340-1351.

8. Journal of immunological methods, 2017, 445: 37-44.

9. Diabetes care, 2013, 36(9): 2543-2550.

小分子、多肽、蛋白一网打尽，看Biacore在肾病药物研究中大显身手

2023年3月9日是第十八届“世界肾脏日”主题为“人人享有肾脏健康，未雨绸缪，支持弱势群体”。近年来慢性肾脏病已成为威胁人类健康的主要疾病之一，由于多数肾脏疾病早期没有特异的临床表现，慢性肾脏病又被称为”沉默的杀手”。而肾脏纤维化（renal fibrosis）是一种常见的病理生理途径，参与多种肾脏疾病的发展。

过往几年中，科研工作者对肾脏纤维化的研究逐步深入，发现了新的治疗靶点，并就此进行药物筛选和研发，今天小编选择了三篇近期国内科研工作者发表的文章，解读在该领域的研究中，用Biacore都解决了哪些问题？

NEU1在肾纤维化中的作用及药物筛选

2023年3月，中国药科大学，南京中医药大学等单位在Nature Communications上面发表题为“Neuraminidase 1 promotes renal fibrosis development in male mice”的文章，报道了神经氨酸酶1（neuraminidase 1，NEU1）在肾纤维化中的作用。研究认为NEU1与TGFβ I型受体ALK5的160-200aa区域结合，可以稳定ALK5，导致SMAD2/3激活，参与肾脏纤维化过程（图1）。

图1：NEU1在肾脏纤维化中的作用机制

文章采用Biacore对NEU1与ALK5的结合，以及结合的具体位置进行了验证。将重组的NEU1蛋白固定在芯片上，ALK51-125aa, ALK5162-403aa, ALK5200-503aa分别作为分析物进样，结果显示仅ALK5162-403aa与NEU1蛋白有结合，亲和力为3.14 nM（图2a）。据此作者认为ALK5的160-200aa区域是与NEU1结合的关键位置（图2c）。

图2：Biacore验证ALK与NEU1的结合，以及结合的关键位点

通过一系列的细胞及动物实验，研究人员确认NEU1在肾脏纤维化中的作用，并提出了以NEU1为靶点治疗肾脏疾病的潜在途径。采用SPR技术对74种药用植物的天然产物与NEU1的结合亲和力进行了筛选（图3a）。其中与NEU1的亲和力最强的是丹参中的活性成分丹酚酸B（salvianolic acid B），达到了21.57 nM（图3b）。随后研究人员在动物模型中比较了丹酚酸B与同样来自丹参的丹酚酸A的作用差异，同样剂量下，丹酚酸B明显表现出更好的缓解肾脏纤维化和肾脏损伤的效果，这与Biacore得到的两者与NEU1靶点的亲和力数据一致（图3）。

图3：针对NEU1靶点的天然产物筛选及表征

Klotho衍生多肽有效抑制肾纤维化

2022年，南方医科大学南方医院，广东工业大学，广州生物岛实验室等单位在Nature Communications上发表了题为“A Klotho-derived peptide protects against kidney fibrosis by targeting TGF-β signaling”的文章，发现一种Klotho蛋白衍生的多肽KP1可以通过靶向TGF-β信号传导保护肾脏纤维化，KP1通过结合TGF-β受体TβR2，抑制TGF-β下游信号通路的活化。

Biacore实验显示，多肽KP1与TβR2的亲和力达到1.41 μM（图4左），明显强于其他的Klotho蛋白衍生多肽KP12（KD=14.4μM，图4右）。后续的实验与Biacore的结果一致，高亲和力的KP1表现出明显的抑制肾脏纤维化的作用，能够有效保留肾脏功能，而KP12却没有表现出抑制TGF-β信号通路的效用。

图4：Biacore检测多肽KP1（左）和KP12（右）与TβR2的亲和力

新型融合蛋白缓解肾脏纤维化

2022年12月，复旦大学儿童医院，重庆医科大学第一附属医院等单位在Frontiers in Immunology发表题为“A novel fusion protein consisting of anti-ANGPTL3 antibody and interleukin-22 ameliorates diabetic nephropathy in mice”的文章，研究人员构建了一种新的融合蛋白，通过下调与肾脏损伤和功能障碍相关的信号通路，在糖尿病性肾病中显示出有效性。

该蛋白由IL-22与anti-ANGPTL3抗体的c端融合形成，文章通过Biacore验证了该融合蛋白的生物学活性（图5）。结果显示融合蛋白anti-ANGPTL3/IL22与anti-ANGPTL3抗体显示了相似的结合能力（图5C）。

图5，Biacore检测融合蛋白anti-ANGPTL3/IL22和anti-ANGPTL3抗体与ANGPTL3的亲和力

后续实验证明融合蛋白anti-ANGPTL3/IL22在保留生物活性的基础上具有更好的稳定性，通过抑制NF-κB P65和NLLRP3炎症小体的表达来缓解肾脏纤维化，在糖尿病性肾病小鼠中表现出明显的保护效果。

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降糖赛道：分子互作技术助您笑傲江湖

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这两年集采“灵魂砍价”的新闻频频出现，特别是在胰岛素领域尤为突出。据估算，2021年全国胰岛素集采量2.1亿支，涉及金额170亿，中选产品价格平均降幅 48%。胰岛素集采对于药企而言，喜忧参半。喜的是，集采后中外企业的市场格局会发生变化，有利于推进中选企业降低生产成本和新药研发，推动产业优化升级。忧的是，短期内股价下降，营收数字下滑，集采阵痛明显。此刻，对于药企而言，研发出质优价廉的产品成为当务之急。今天，我们就通过赛诺菲研发Insulin aspart Sanofi剑指诺和诺德NovoRapid的案例，看分子互作“金标准”的Biacore如何助你在降糖赛道笑傲江湖。

胰岛素领域的头把交椅一直被诺和诺德占据，NovoRapid更是业界明星产品。2020年，欧盟委员会批准Insulin aspart Sanofi上市，这对NovoRapid产生巨大挑战。SAR341402（Insulin aspart Sanofi）是由赛诺菲公司研发，以NovoRapid为原型药，经EMA批准上市的胰岛素类似药。SAR341402是利用重组DNA技术由非致病性大肠杆菌产生的速效胰岛素，其与人胰岛素同源，唯一的不同点在于将人胰岛素氨基酸链 B28 位的脯氨酸替换为天门冬氨酸。正是由于此修饰使得门冬胰岛素通过电荷排斥效应阻止胰岛素自我聚合，从而达到起效快、活性高的特点。

在SAR341402申报报告中，与受体的结合活性测定是药效学研究的重点。面对众多分子互作的检测技术，研究人员最终选择了Biacore SPR技术，理由很简单：快速、实时、直接的检测方法受到研究人员的认可（在讲究内容精简的药物申报报告中，点出Biacore SPR技术具备的三大优势，着实可见研究人员对于Biacore的喜爱）。在检测实验中，研究人员首先将胰岛素受体IR-A 或 IR-B偶联在Biacore传感芯片上。随后，将SAR341402 （四个批次）、参考药物（NovoLog、NovoRapi 各三批）在特定浓度范围内进行检测，每批次药物重复6次实验。四个检测数据（ka1, kd1, ka2, kd2）分别拟合计算，同时计算每个药物对应的加权几何平均值，并且获得对应95%置信区间（见下表）。

获得上述数据后，再对三个药物进行两两对比，获取比值及对应90%置信区间（见下表）。针对于结合和解离速率常数 ka1、ka2、kd1、kd2，平均结合和解离速率常数比值的90%置信区间落在 0.70 – 1.43 接受度范围内，表明了SAR341402与参考药物在胰岛素受体IR-A 、 IR-B的结合动力学数据上是相似的。

随后，研究人员再将IGF-1受体偶联在Biacore传感芯片上，按照与胰岛素受体相似的检测方法进行检测，拟合计算获得四个检测数据（ka1, kd1, ka2, kd2），同时计算每个药物对应的加权几何平均值，并且获得对应95%置信区间（见下表）。

获得上述数据后，再对三个药物进行两两对比，获取比值及对应90%置信区间（见下表）。针对于结合和解离速率常数 ka1、ka2、kd1 和 kd2，平均结合和解离速率常数比值的90%置信区间落在 0.70 – 1.43 接受度范围内，表明了SAR341402与参考药物在IGF-1受体的结合动力学数据上也是相似的。

对于上述实验数据，可能有些小伙伴会疑问：这些数据到底表现出Biacore哪些惊艳的特点？作者认为可以用一句话概括：高数据质量下的高通量检测与大数据分析能力。

首先，两位点结合模型，三药物直接对比，十批次药物检测，一百八十组数据分析，这都表现出Biacore具备多样的结合模型分析模块，高通量检测速度，大数据分析处理能力。此外，如此亮眼的CV数据更是让人惊艳于Biacore的整体数据质量。这么大样本，低CV值的数据结果，就要求仪器检测精度与稳定性必须非常高。作为行业的金标准，Biacore检测精度与检测稳定性是市面其他设备无法相提并论的。

其次，千分之一度的温控精度保障了检测温度敏感型样品的刚性需求，而且，样品板封膜与钢针穿刺取样的设计保证了整个检测过程中样品浓度始终不变，保证无论检测时间长或短，样品顺序前或后，数据重复性超高的效果。也就是因为Biacore如此优异的表现，助力了赛诺菲Insulin aspart Sanofi的上市。

向来枉费推移力，此日中流自在行。在如今竞争激烈的降糖赛道，Biacore将通过“金标准”的品质，助力药企研发更优的产品，让患者少花钱用好药，让企业面对竞争，从容应对，笑傲江湖。

群雄逐鹿，GLP-1RA赛道到底谁是最终赢家？

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2022年5月13日，FDA正式批准了由礼来研发的双靶点受体激动剂Mounjaro（Tirzepatide），用于治疗II型糖尿病和肥胖（图1）。Tirzepatide是一个含有39个氨基酸的多肽，可同时激动胰高血糖素样肽-1（GLP-1）和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽（GIP）受体，有效控制血糖。临床研究表明，Tirzepatide在改善血糖方面比其他治疗方法更有效。

图1 Tirzepatide FDA批准文件

回溯糖尿病治疗药物的发展史，自1922年胰岛素首次成功应用于糖尿病治疗以来，糖尿病药物仍在不停研发升级。当今市场上有多种降糖药可供选择，如双胍类、胰岛素类、GLP-1受体激动剂（GLP-1RA）等等，其中GLP- 1RA是近年来新型降糖药物的主战场。

胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）是一种主要由肠道L细胞所产生的内源性激素。GLP-1通过激活GLP-1受体（GLP-1R），可以促进胰岛素的分泌，抑制胰高糖素分泌，并能够延缓胃排空，通过中枢性的食欲抑制减少进食量，从而达到降低血糖，减肥等作用。但天然GLP-1的半衰期非常短，各类可以发挥类似作用的降糖药GLP-1RA逐渐在市场出现。纵观GLP-1RA的研发历史，Biacore在药物筛选、长效化、免疫原性的研究中都发挥了核心作用，下面就详细盘点一下Biacore的精彩表现吧。

01. Biacore推动Lilly划时代的GIP/GLP-1R双靶点激动剂的设计

诺和诺德的司美格鲁肽（Semaglutide）一度被认为是GLP-1RA的终极产品，在PEG化GLP-1RA的同时，融合了针对DPP-4降解的改造。而Lilly此番的双靶点GLP-1RA，打破了司美格鲁肽的垄断地位。Lilly基于双功能协同药理作用的假设，设计了同时激动GLP-1和GIP受体的Tirzepatide。2022年礼来在PNAS上发表文章“Structural determinants of dual incretin receptor agonism by Tirzepatide” ，揭示了Tirzepatide与两个受体的高分辨率结构，并且基于Biacore及其他方法，在分子水平上更好地解释了Tirzepatide在GIPR和GLP-1R上的独特配体结合和药理特征。

对于包括GIPR和GLP-1R在内的B类G蛋白偶联受体(GPCRs)而言，N端ECD是一种独特的结构特征，与配体识别机制有关。研究人员使用Biacore T200，将两个受体GIPR及GLP-1R的胞外域固定于芯片表面，将原始设计Tirzepatide(TZP)，去除C20的Tirzepatide^ΔC20(TZP ^ΔC20)，GLP-1类似物（Ex-4）以及GIP，作为分析物流经芯片表面，快速获得亲和力/动力学检测数据。

图2&表1：Tirzepatide、去脂Tirzepatide以及GLP-1类似物、GIP与不同受体的亲和力动力学检测

实验结果表明，Tirzepatide与GIPR的结合在µM级别， Tirzepatide亲和力K_D= 4.2 μM ， Tirzepatide^ΔC20亲和力K_D = 1.7 μM，证明不含脂肪酸链的Tirzepatide ^ΔC20，与GIPR的结合更强。针对GLP-1R的检测均具有更高的亲和力，Tirzepatide亲和力K_D= 23 nM， Tirzepatide^ΔC20 亲和力K_D= 111 nM，证明增加了脂肪酸链后(Tirzepatide)的亲和力提高。GLP-1类似物（Ex-4）与GLP-1R受体的亲和力在10^-8级别，而GIP与GIPR的亲和力在10^-5级别，这说明两个受体对于天然激动剂的亲和力本来就存在差异。综合评估后，选择了加上脂肪酸链的设计方案，可以维持更高的GLP-1RA亲和力的同时，牺牲部分GIP亲和力，与天然激动剂与受体的亲和力保持一致，并且大大提升了其半衰期。

Biacore助力Tirzepatide在分子层面确定与两个受体的结合情况，最终促生了这一代全新的双靶点GLP-1RA的横空出世！

02. Biacore助力长效化GLP-1RA设计与筛选

胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）具有半衰期短的问题，给药后由于酶的水解作用或肾小球的滤过损失，使得药物体内存留时间较短。为了应对GLP-1类似物半衰期短的问题，通常的做法是将其融合到一个大的蛋白，例如白蛋白、Fc或者能和白蛋白结合的结构域上，以延长其在体内的存留时间。首当其冲的是诺和诺德在2010年上市的一款具有里程碑意义的GLP-1RA——利拉鲁肽（Liraglutide），利用脂肪酸链结合白蛋白的GLP-1形式，有效延长药物的半衰期，可以实现每周一次给药。

研究人员一直在不断尝试不同类型的长效化方案。暨南大学在RSC Advances发表的一篇文章，“Design and evaluation of novel thrombin-based GLP-1 analogs with peptidic albumin binding domain for the controlled release of GLP-1”揭示了一种通过不同脂肪链长度的七肽标签结合至白蛋白的GLP-1RA优化设计方案，文章中采用Biacore筛选获得了可高亲和地结合于白蛋白的全新GLP-1类似物PES14，有效延长体内的半衰期。

研究表明七肽标签与人血清白蛋白（HSA）具有很好的亲和力，研究团队使用一个由柔性连接子(GGGGS)₂和凝血酶(TBN)可切割位点(FNPR)组成的中间序列，将一系列具有不同脂肪链长度的七肽标签融合到突变的GLP-1的N端，设计并制备了21个融合肽，命名为PESO1-PES21（图2）。

图2 七肽融合GLP-1设计示意图

随后，使用Biacore进行了融合肽与HSA的亲和力筛选，从结果中可以看到（表2），在二十多个融合肽中，PES13， PES14，和PES15 与HSA具有较强的亲和力（PES13，3.83×10^-7 M；PES14，6.96×10^-7 M；PES15，5.12 10^-7 M）。更为重要的是，由于Biacore不仅可以获得亲和力数据，还可以同时获得解离速率常数kd，通过关注这三组样品的kd，发现亲和力强的原因是因为具有较慢的解离速率，说明其与HSA的结合稳定性较强，这也是我们进行长效化设计的主要目的。后续针对这三例药物，进行血浆稳定性实验及动物实验，确定了基于此设计的PES14在保证药物有效性的同时，极大地提升了药物的半衰期。

表2 融合肽与HSA的亲和力/动力学筛选

在长效化策略的更新迭代中，我们见证了GSK的阿必鲁肽（Albiglutide），Lilly的度拉糖肽（Dulaglutide），诺和诺德的司美格鲁肽（Semaglutide）的诞生。今后GLP-1RA的赛道上，长效化设计仍会是经久不衰的议题，而Biacore必将在长效化设计上持续助力。

03. Biacore助力多种GLP-1RA免疫原性检测

药物在体内会引起免疫应答，轻则中和药效，重则引起不良反应。免疫原性涉及药物的安全性和有效性，因此FDA、EMA等法规均将药物免疫原性列为强制性要求的检测项目。在2020中国药典中，已将Biacore基于的SPR技术列为了免疫原性检测技术。在FDA免疫原性指导原则中，将SPR技术与ELISA、RIPA一同列为了推荐的三种筛选方法。在GLP-1RA赛道，赛诺菲公司的利西拉肽等就基于Biacore完成了免疫原性数据申报，结果证实了Biacore具有抗药性抗体检出率高的优势。诺和诺德的明星产品司美格鲁肽同样也采用Biacore进行免疫原性检测方法的开发（图3）。

图3. 赛诺菲-利西那肽（左）和诺和诺德-司美格鲁肽（右）基于Biacore进行免疫原性检测

无论是诺和诺德还是礼来，无论是国外还是国内，GLP-1RA赛道的这场战役终究没有结束。诺和诺德的多靶点GLP-1RA正虎视眈眈；现在大多剂型均为注射用药，口服小分子GIP-1RA研发也已在途。作为唯一被中国、美国、日本药典收录的分子互作检测技术，Biacore已经广泛应用到GLP-1RA多肽药物的各开发环节。Biacore 作为分子互作检测金标准，也可以广泛用于抗体、疫苗、多肽、小分子药物的研发、机理研究、免疫原性、质控放行等各环节，将继续为新药开发护航助力。无论谁能称霸这一片市场，Biacore都希望可以继续见证GLP-1RA的迭代升级！

参考文献：

1.Niu X， Nong S， Zhang X， et al. Design and evaluation of novel thrombin-based GLP-1 analogs with peptidic albumin binding domain for the controlled release of GLP-1. RSC Adv. 2020;10(8):4725-4732. Published 2020 Jan 29. doi:10.1039/d0ra00104j

2.Sun B， Willard FS， Feng D， et al. Structural determinants of dual incretin receptor agonism by Tirzepatide. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022;119(13):e2116506119. doi:10.1073/pnas.2116506119

3.Marbury TC， Flint A， Jacobsen JB， Derving Karsbøl J， Lasseter K. Pharmacokinetics and Tolerability of a Single Dose of Semaglutide， a Human Glucagon-Like Peptide-1 Analog， in Subjects With and Without Renal Impairment. Clin Pharmacokinet. 2017;56(11):1381-1390. doi:10.1007/s40262-017-0528-2

关爱老人，让“夕阳”更美 — Biacore在帕金森氏症发病机制及治疗药物开发中的应用

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帕金森氏症（Parkinson’s disease，简称PD）是一种影响中枢神经系统的神经退行性疾病，是四大常见的神经退行性疾病之一。目前帕金森氏症治疗手段有限，临床上多以脑深层刺激手术以及左旋多巴(levodopa)和多胺激动剂(dopamine agonists)的药物治疗为主。无论是药物治疗或者神经外科手术，都仅能减轻疾病症状，且伴有不同程度的并发症与副作用。

至今帕金森氏症的致病机制尚不清楚，学界普遍认为与中脑黑质多巴胺神经元退化相关。目前的研究证据发现α-突触核蛋白（α-synuclein）在中脑黑质多巴胺神经元的病理性高表达并聚集是导致其致病的主要原因之一。虽然已经发现使用反义寡核苷酸和siRNA在帕金森病模型中使α-synuclein表达量降低，对多巴胺神经元能起到保护作用。但由于他们穿越血脑屏障和神经元细胞膜的能力有限，无法有效到达病灶，仍不能满足临床治疗的需求。因此找到能穿越血脑屏障和神经元细胞膜的药物对于PD的临床治疗十分重要。

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重庆医科大学附属儿童医院与加拿大英属哥伦比亚大学合作在Nature子刊Communications Biology发表题为Development of an α-synuclein knockdown peptide and evaluation of its efficacy in Parkinson’s disease models的研究论文，报道了由加拿大皇家科学院院士王玉田教授团队开发的一种多肽Tat-βsyn-degron，能够快速降解α-synuclein，在帕金森病小鼠模型中显著降低由帕金森诱导的神经元损伤和运动损伤，是一种有潜力的帕金森症临床治疗手段。

研究人员开发的这种靶向α-synuclein的多肽Tat-βsyn-degron包含三个结构域(1) N端质膜转导结构域Tat，能够有效穿透血脑屏障和神经元细胞膜 (2) α-synuclein蛋白结合域β-syn（β-synuclein），由β-syn的36-45位氨基酸组成 (3)蛋白酶体靶向结构域degron，介导α-synuclein与蛋白酶体的结合，诱发蛋白质降解( 图1a)。

那么这种构建的治疗性多肽药物是否能够特异性结合α-synuclein呢？研究人员构建了两个FLAG标记的靶向多肽（FLAG-βsynN-degron和FLAG-βsyn-degron，图1b），为βsyn的36-45之间的天然或反向氨基酸序列，并含有Degron结构域。然后利用Biacore直接验证了构建的多肽药物与α-synuclein的结合。

图1 Tat-βsyn-degron多肽设计

研究人员首先使用CM5芯片偶联α-synuclein蛋白 (1500RU, in 10mM acetate buffer, pH 3.1) ，然后将Tat-βsynN-degron和Tat-βsyn-degron稀释成不同的浓度梯度 (0.20, 0.39, 0.78, 1.56, 3.13, 6.25, 12.50 μM)进样(30 μL/min, 180s)。结果显示，两种多肽虽然使用βsyn36-45位天然或反向的氨基酸序列，但与α-synuclein结合的传感图与信号强度相似，同时也确认这两个多肽具有相似的亲和力（图2cd）。而作为对照的HBS缓冲液和只有Tat结构域的多肽，与偶联的α-synuclein没有结合或仅有很低的信号（图2ab）。通过比较不同多肽进样200s的响应值（图2e），可以看到构建的多肽能特异性靶向α-synuclein。其中βsyn结构域是结合α-synuclein的主要位点。

图2 Biacore检测两种多肽FLAG-βsynN-degron和FLAG-βsyn-degron与α-synuclein的结合

因为Tat -βsyn-degron比Tat -βsynN-degron更稳定，研究人员选择Tat -βsyn-degron用于后续的动物实验。在PD 的M83小鼠模型中，腹腔注射Tat-βsyn-degron能够显著降低 α-synuclein的聚集。在PD的MPTP小鼠模型中，Tat-βsyn-degron短肽在降低α-synuclein寡聚体，减少多巴胺神经元死亡的同时，能够挽救MPTP小鼠模型的运动损伤。

图3 文章整体研究思路

回顾整篇文章，研究人员采用Biacore在分子水平上证实了构建的多肽药物与靶点结合的特异性，在两个PD的动物模型中都表明Tat-βsyn-degron能有效降低α-synuclein，是一个有潜力的临床治疗手段。

除了帕金森氏症之外，Biacore在其他神经退行性疾病如阿尔茨海默症（Alzheimer’s Disease，AD）的发病机制和治疗药物开发中也都有十分耀眼的表现，点击此处立即查看：通过8个故事，看Ta对于Alzheimer研究的巨大贡献。

综上所述，Biacore作为被中美日药典收录的分子互作技术，已广泛应用于多种神经退行性疾病的发病机制研究，也助力一大批治疗药物如Aducanumab抗体、GV-971(甘露特钠胶囊)等从研发走向上市。相信有了Biacore的助力，科学家们对神经退行性疾病的发病机制研究会更加深入，未来还会有更多有效的治疗药物出现，人类未来的老年生活值得期待！

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正式收录中国药典，Biacore 持续助力糖尿病药物研发

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7 月 2 日，国家药品监督管理局、国家卫生健康委发布公告，正式颁布 2020 年版《中华人民共和国药典》，此版药典将于今年 12 月 30 日起正式实施。

其中，以 Biacore 为代表的表面等离子共振法（SPR）正式收录于新版药典，以其直接测定结合反应，并能精密测定亲和力，包括结合/解离速率的优势，被推荐用于免疫原性测定、结合活性测定、分子间亲和力测定以及复杂样品中待定蛋白质浓度的测定（图 1）。

图 1，中国药典 2020 版关于 SPR 的部分截图

作为分子互作检测的金标准，Biacore 一直是药物研发与申报中必不可少的工具，已经广泛应用于抗体、重组蛋白、疫苗、小分子化合物等药物的研发与生产，超过 80% 的已上市抗体药均使用 Biacore 数据进行申报。除此之外，Biacore 在很多临床疾病的机理研究及治疗性药物研发过程中，均有广泛应用。这里详细介绍 Biacore 在糖尿病治疗药物开发中的应用。

GLP-1 类似物长效化

在糖尿病药物的研发中，GLP-1 受体激动剂无疑是最受瞩目的一类，目前上市的艾塞那肽（Exenatide）和利拉鲁肽（Liraglutide）都是 GLP-1 类似物。GLP-1 是人体肠道细胞分泌的一种肽类激素，通过结合 GLP-1 receptor 激活下游信号通路，以维持体内葡萄糖水平的平衡和营养物质代谢正常。

但是，作为一种多肽类药物，由于酶的水解作用和肾小球的滤过损失，GLP-1 类似物在体内的留存时间很短，研发人员一直致力于对 GLP-1 类似物进行改造，以延长其在体内的半衰期，提高药物的作用效果。

去年 9 月刊登在 RSC Advances 上的文章就报道了同济医院的研究人员改造得到的一种新的多肽药物，通过在 GLP-1 上连接一个白蛋白结合域（Albumin binding domain，ABD），来延长药物在体内的半衰期。其中，两种不同的 ABD 序列与人血清白蛋白的亲和力检测就是用 Biacore 完成的（图 2）。

图2：Biacore检测RetroMyelin原件与转录因子SOX10的互作结果

图 2 两种不同的 ABD 序列 XTS1/2 与人血清白蛋白结合亲和力

▶ 今年研究人员又创新性地设计了一种双特异性的 GLP-1 融合蛋白，这种全新的单链抗体融合蛋白 Everestmab 由三个部分组成：

突变的 GLP-1（A8 G），提高了对一些水解酶的抵抗能力；
人源化的纳米抗体 Anti-HSA，可以高亲和地结合白蛋白，有效逃逸肾小球滤过作用，提高药物半衰期；
人源化的纳米抗体 Anti-GLP-1R，特异性结合 GLP-1R，提高 GLP-1 激活靶点的效率。

在 Everestmab 的设计中，纳米抗体 Anti-HSA 和 Anti-GLP-1R 的亲和力直接决定了这种全新药物的作用效果。而这两个核心数据都是通过 Biacore 直接测定的。Biacore 检测结果显示 Anti-HSA 与人 HSA 的亲和力高达 0.83nM（图 3A），保证了药物在体内具有长的半衰期。而融合的 Anti-GLP-1R 纳米抗体可以精准靶向 GLP-1R，从而让 GLP-1 高效激活下游信号通路，发挥药效。Everestmab 集合了纳米抗体分子量低、特异性高，半衰期长，且亲和力高的优势，是一种潜在高效的糖尿病治疗药物。

图 3，Biacore 测定 Anti-HSA 与人（A）和猴（B）白蛋白结合的亲和力

糖尿病候选药物筛选

除了上述创新型药物开发之外，在糖尿病治疗药物的筛选中，Biacore 同样能够帮助研究人员快速高效的筛选到候选药物。最近，来自暨南大学的研究人员合成了一系列多肽类候选药物（PEP01-20），并以 GLP-1R 为靶点，用 Biacore 8K 进行了快速筛选。结果发现 PEP16 偶联了脂肪酸链之后得到的 PEP20 与 GLP-1R 的亲和力为 0.025μM（表 1），并且在体内展现了显著的促进胰岛素释放的活性和降低血糖水平的能力，长期给药效果与利拉鲁肽（Liraglutide）相当。

表 1，多肽类候选物与靶点 GLP-1R 的亲和力

Biacore 8K 在传承 Biacore 设备高数据质量的基础上，全新的 8 根进样针设计能够平行检测至少 8 种不同的样品，每天能够完成 2400 多个样品的检测。非常适合大量药物筛选与精确表征的实验，并且能够在最短时间内提供可信的高质量数据，从而大量节省实验时间，节省耗材成本，在药物筛选及精确表征中发挥着至关重要的作用。

糖尿病并发症发病机理研究

及治疗性天然产物发现

糖尿病除了与高血糖相关的「三多一少」（多饮、多尿、多食和体重减轻）的典型症状之外，还能引起一系列的并发症，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。其中糖尿病肾脏疾病（DKD）是慢性肾脏病的主要原因，目前治疗方法十分有限。而在我国传统中医中，有很多名方与草药用于治疗糖尿病及其并发症。其中，牛蒡子（Fructus Arctii）用于治疗 DKD 患者，可以显著降低 DKD 患者的蛋白尿水平，但其疗效背后的机制仍然不明。

牛蒡苷元（ATG）是牛蒡子的主要成分，通过不懈努力，科研人员找到了 ATG 在体内的靶点 PP2A，并用 Biacore 直接验证了 ATG 和 PP2A 的结合（图 4）。研究表明 ATG 可以调节 PP2A 亚基结构并增加其活性，是一种新型的 PP2A 激动剂。ATG 作为 PP2A 激动剂不仅可以用来治疗肾病，且具有普遍的抗炎症和抗肿瘤作用，因此具有十分广泛的应用前景。

图 4，Biacore 直接检测 PP2A 和 ATG 的结合

除了进行候选药物筛选和亲和力精确表征之外，Biacore 不仅可以找到治疗相关疾病的天然产物的潜在靶标，也可以通过特有的「垂钓与发现」功能，帮助发现中药等天然产物的有效成分，为包括中药在内的天然产物研究开辟新的途径。

总结

作为中美日三国药典收录的分子互作技术，Biacore 已广泛用于抗体、疫苗、多肽、小分子药物研发以及质控的各个环节。不仅在糖尿病药物的研发中发挥了重要作用，在其他许多药物的申报材料以及科研成果中都可以看到它的身影。

Biacore 高灵敏度、高重复性的硬件性能满足了高通量筛选、新药报批、临床分析和生产质控对数据质量和可靠性的严格要求，设备符合 GxP 和 21 CFR Part 11 的要求，将继续助力新药开发，共同实现创新疗法的可及，变革人类健康的未来。

参考文献：

1. Pan H, Xie Y, Lu W, et al. Engineering an enhanced thrombin-based GLP-1 analog with long-lasting glucose-lowering and efficient weight reduction[J]. RSC Advances, 2019, 9(53): 30707-30714.
2. Pan H, Su Y, Xie Y, et al. Everestmab, a novel long-acting GLP-1/anti GLP-1R nanobody fusion protein, exerts potent anti-diabetic effects. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2020;48(1):854-866.
3. Zhong X, Chen Z, Chen Q, et al. Novel Site-Specific Fatty Chain-Modified GLP-1 Receptor Agonist with Potent Antidiabetic Effects[J]. Molecules, 2019, 24(4).
4. Zhong Y, Lee K, Deng Y, et al. Arctigenin attenuates diabetic kidney disease through the activation of PP2A in podocytes.[J]. Nature Communications, 2019, 10(1): 4523-4523.