文献速递丨MabSelect VH3 在复杂抗体中的案例集锦

Cytiva于2023年推出的MabSelect VH3抗体亲和填料，其配基是经过重组改造的Protein A，敲除了与Fc区域的结合位点，并显著增强了与VH3序列家族人源抗体重链可变区的结合能力，在提高对Fab、VHH片段结合载量的同时，也保持了高耐碱性^【1】。其特点简单归纳如下：

• 高结合载量：DBC（6 min RT） > 70 g mAb/L。
• 优异耐碱稳定性：0.5 M NaOH （15 min/cycle）> 200次。
• 高特异性：专一结合含有VH3序列的抗体和抗体片段。

在复杂抗体分子的纯化中，需要根据目标分子与杂质之间的结构及组成差异筛选具有不同结合特异性的亲和填料（如图1所示），以找到最佳的分离方案。 其中，MabSelect VH3仅专一性结合VH3结构域，非常适用于纯化产品与副产物之间具有不同VH3结构域数量的双抗（bispecific antibody, BsAb）与三抗（trispecific antibody, TsAb）等。

在2025年发表的四篇文献中【2-5】，共同关注了一个明确的工艺问题：针对含 VH3 结构域的复杂抗体（比如TsAb、bsAb 、VHH based scaffold），如何在捕获阶段实现对结构性副产物的有效分离与去除。在传统Protein A（Fc 结合或 Fc+VH3 双结合）体系中，作者们反复指出以下工艺痛点：结构正确的目标分子与同源二聚体（homodimers）、半抗（half antibody）、聚集体（aggregates）在 Fc 结合层面缺乏足够差异；亲和阶段更多承担“捕获”而非“分离”功能；导致后续 polishing 步骤负担显著增加。

MabSelect VH3的配基经工程化改造，去除了Fc结合能力，仅保留对VH3结构域的特异性结合，分离驱动力从Fc亲和差异→VH3结构域数量或结合价态（binding valency）差异，为捕获阶段引入了一个新的分离维度，这也是四篇文献的共同起点。

WuXi Biologics团队的Fang等发表的文献中，目标分子为基于VHH的TsAb，如图2所示，其含有3个VHH结构域，其中仅knob侧含有1个VH3型。其副产物包括半抗（half antibody）、同源二聚体（homodimers）和聚集体（aggregates），与目标TsAb的主要差异在于所含VH3结构域的数量不同。

文献中比较了Cytiva三款Protein A填料在TsAb纯化过程中，对上述副产物的去除能力：

01

MabSelect SuRe LX（仅 Fc 结合），分离行为完全依赖Fc亲和力，根据作者既往经验，其在捕获阶段基本不具备结构性分离能力，通过Fc区结合的杂质通常与目标物共洗脱，如图3A，仅产生单峰，主峰中仍含大量hole-hole homodimer和其他副产物。

02
MabSelect PrismA（Fc+VH3结合），分离行为受Fc与VH3两种作用力叠加影响，其分离效果优于SuRe LX，如图3B，出现3个峰，分别对应half-antibody、hole-hole homodimer、目标TsAb，但无法完全去除knob-knob homodimer和aggregates（约6%残留）。

03
MabSelect VH3（仅VH3结合），分离行为基于VH3结构域数量，如图3C，分离效果最佳：不含VH3的副产物（half-antibody、hole-hole homodimer）直接流穿；含2个及更多VH3的副产物（knob-knob homodimer、aggregates）结合更牢，滞留在尾峰；目标TsAb（1个VH3）结合中等 → 主峰洗脱（fraction 1&2），获得高纯度TsAb。

将上述MabSelect VH3的pH线性洗脱转化为30 mM HAc（pH 3.9）的一步step洗脱，再次验证了其对聚集体（aggregates）卓越的去除能力，主峰单体比例达96-98%，说明MabSelect VH3可有效分离含不同数量VH3结构域的抗体及其副产物，且有较好的聚集体分离能力，在基于VHH的TsAb纯化中显著优于传统Protein A。

WuXi Biologics团队的W. Dong等发表的文献中分享了两个纯化案例，具体如下：

01
目标分子包含1个VH3域，其主要副产物为knob half-antibody（0个VH3）和hole-hole homodimer（2个VH3），如图4A。

02
MabSelect VH3纯化结果如图4B，不含VH3的knob half-antibody流穿；主峰（fraction 1-3）为纯度较高的目标 bsAb（1个VH3）；含2个VH3的hole-hole homodimer 结合更牢，集中在尾肩峰。另外，fraction 4中检测到的knob half-antibody推测是knob和hole两个半抗通过非共价相互作用结合的副产物（此构象不稳定，易聚集）在SDS-PAGE中的解离行为导致。

03
为了更好地分离目标bsAb与hole-hole homodimer，将pH线性梯度从原来的0-100% B over 20 CV改为58-100% B over 30 CV，使梯度更缓，以提高分辨率，如图4C，洗脱曲线呈现出两个分离良好的峰，主峰（fraction 1-6）为纯度更高的目标bsAb，而次峰（fraction 7–9）则主要包含 hole-hole homodimer及其他杂质。

01
目标分子VH3 homodimer（2个VH3），副产物为half-antibody（1个VH3）和大量聚集体（多个VH3），如图5A。

02
MabSelect VH3纯化结果如图5B，有3个洗脱峰：half-antibody的VH3域数量少，结合相对较弱，最早洗脱；目标二聚体为中间主峰；聚集体结合最强，最晚洗脱。

结果再次表明，在副产物与主产物VH3数量不同的体系中，MabSelect VH3可在捕获步骤同时去除产品相关杂质，提高纯化效率，降低后续精纯压力。

另外，作者发现与常规Protein A填料相比，MabSelect VH3表现出显著的聚集体分离优势，能让单体与聚集体在洗脱峰中实现高度分离，这可能是因为聚集体携带多个VH3结构域，多点弱相互作用叠加时，MabSelect VH3 的价态选择特性可被转化为有效的单体-聚集体分离窗口，聚集体结合相对更强，更晚被洗脱。

已有研究表明，抗体与Protein A配基之间的结合（包括/尤其是VH3区域的互作）主要由疏水相互作用主导，在洗脱液中添加NaCl有助于增强疏水效应，且对于聚集体和Protein A配基的结合增强程度通常高于单体，进一步增加了二者的结合差异，促进分离。

作者通过优化洗脱策略，从pH线性梯度到pH-盐双线性梯度，再到pH-盐等度洗脱，发现在关键盐浓度和pH区间下单体-聚集体之间的结合强度差异会被进一步放大，使单体相对较早洗脱，而聚集体的洗脱则被进一步延迟（strip 步骤），从而在色谱上形成有效分离，如图6所示，可将聚集体从约25%降至2.9%，单体回收率高达95.7%。

结果表明，MabSelect VH3 的聚集体分离能力不仅依赖于 VH3特异性结合本身，更源于盐浓度调控下疏水相互作用差异的放大效应。该机理同时为传统Protein A在捕获步骤中通过合理设计 pH-盐协同梯度，实现高纯度与高回收率提供了理论依据。

南京正大天晴制药有限公司的X. Liang等发表的文献， 如图7所示，目标bsAb与副产物（两类homodimer）分别含有不同数量的VH3结构域，同时其Fc与Protein A的结合强弱也不同：

• VH1:VH1（homodimer）：无VH3，Fc结合力最强（占比>30%的副产物，为主要杂质）
• VH1:VH3（目标 bsAb）：含1个VH3，Fc结合中等
• VH3:VH3（另一类 homodimer）：含2个VH3，Fc结合力最弱（占比约 2%）

文献中比较了Cytiva三款Protein A填料在上述bsAb纯化过程中，去除同源二聚体的能力：

01
在线性pH梯度洗脱条件下，MabSelect PrismA与MabSelect SuRe LX均表现出一定程度的同源二聚体分离能力，如图8A和8B，但双结合模式（Fc+VH3） 的PrismA，其分离效率反而低于仅依赖Fc结合的SuRe LX（Rs 0.78 vs 0.64）。说明在Fc亲和差异与VH3数量差异同时存在时，Fc结合往往主导洗脱行为，双重结合机制未必增强分离，反而可能因VH3 binding产生相互抵消作用而削弱依赖Fc差异的分离效果，导致色谱分辨率下降。

02
相比之下，MabSelect VH3完全消除了Fc介导的结合，展现出显著不同的分离行为，如图8C，不含VH3的VH1:VH1同源二聚体在上样阶段直接流穿，从而实现对高丰度杂质的高效去除；含1个VH3的目标bsAb表现出中等结合能力并优先洗脱，而含2个VH3的 VH3:VH3同源二聚体则因强结合而后洗脱。

03
将上述MabSelect VH3的流穿加载到MabSelect PrismA进行二次验证，如图8D，CEX-HPLC结果显示PrismA洗脱液中90.4%为VH1:VH1，证明VH1:VH1成分确实在MabSelect VH3上完全不结合。

04
在同时存在Fc与VH3差异的体系中，仅依赖VH3结构域相互作用的MabSelect VH3具有最佳分离性能，如图8E，最终获得的目标bsAb纯度＞98.9%，明显优于其他两种填料。

另外，作者使用Whatman 96孔过滤板填充20 μL填料进行高通量DoE实验，比较MabSelect SuRe LX和MabSelect VH3在等度pH洗脱条件下的可操作窗口。结果显示，洗脱pH是影响纯度和收率的主要因素，上样量的影响则相对较小。对于MabSelect VH3，在较宽的上样量（20-50 g/L）和较温和的洗脱pH（4.0-4.2）范围内，均可稳定获得纯度＞96%的VH1:VH3和超过60%的收率；相较之下，MabSelect SuRe LX 虽然具有分离效果，但工艺窗口窄，提高纯度需要显著牺牲收率。

总的来说，如果目标bsAb与错配homodimer在Fc和VH3结合特性上同时存在差异时，应避免在捕获阶段引入彼此竞争的结合机制。此时，MabSelect VH3可作为首选，可实现主要副产物流穿（比如VH1:VH1），并将洗脱条件优化为等度pH洗脱，不需依赖梯度斜率或洗脱切割精度，使纯化流程更简单，从而获得更宽的操作窗口和更高的工艺稳健性。

礼来实验室的A.S. Ransdell等先系统性评估了MabSelect VH3 与 MabSelect PrismA在不同VHH based scaffold中的结合载量和选择性捕获能力，研究对象包括VHH、Fab‑VHH、单克隆抗体（mAb）等，如图9所示。

结果显示，MabSelect VH3 对大多数VHH、Fab‑VHH表现出更高的结合载量（~33-35 mg vs PrismA ~26-28 mg）和回收率（平均~84% vs PrismA ~70%）；对canonical VH3 mAb（典型VH3序列）的结合载量、回收率和单体比例与PrismA相当；但对non‑canonical VH3 mAb（非典型VH3序列，比如含R19K或K/T57I突变）的结合载量和回收率与VH3序列明显相关，而PrismA基本不受影响。样品回收率数据请参考表1。

另外，高盐淋洗可以降低宿主细胞蛋白（HCP）水平，在相同高盐淋洗条件下， MabSelect VH3洗脱产物中的整体 HCP 含量大多情况下低于 MabSelect PrismA。

结果显示，对含canonical VH3序列的VHH、Fab、Fab‑VHH和mAb，MabSelect VH3表现出DBC（10%穿透，QB, 10%）>30  mg/mL 的稳定结合载量，与Cytiva在MabSelect VH3产品说明书中提供的数据一致。对于non‑canonical VH3，结合价态（binding valency）为双价的mAb表现不同程度的结合，其中T57I或T57Q突变会导致结合载量显著下降，T57I+K64Q双突变会导致不结合；但单价的Fab受VH3序列影响更大，T57I或T57Q突变均会导致不结合。

因为VH3配基与VH3区的特定位点结合，如果互作结构中的核心氨基酸发生突变，则会影响结合载量。所以，在VHH based scaffold序列设计时，特定位点尽量避免使用这些不利于结合的氨基酸，如表2所示，仅供参考。

另外，作者继续进行了单臂单抗（One‑Armed mAb，OAM）的纯化，其结构如图10所示。

预处理后的细胞培养上清，通过两步亲和层析纯化：先经过5 mL HiTrap MabSelect PrismA初步捕获，所得产物包括61.6% OAM、18%聚集体（HMW）、9.1% mAb同源二聚体和11.2% 截短重链二聚体（Fc-stump）；再将PrismA纯化后的样品取10 mg加载至1 mL MabSelect VH3，进行二步纯化。

结果显示，在10 mg上样条件下，不与VH3结合的Fc-stump直接流穿；单价OAM结合弱，在pH 3.9下先洗脱，纯度 >95%，回收率约78%；双价mAb同源二聚体及多价HMW结合牢，在降低pH至3.7后洗脱；更低pH 2.7 洗脱产物主要为 HMW杂质，如图11所示。

所以，利用MabSelect VH3的结合价态差异，并通过步级pH洗脱，可在捕获阶段高效去除不对称抗体的产品相关杂质。

MabSelect VH3的配基删除了与Fc区域的结合，并显著增强了与人源VH3序列的特异性结合。从工艺控制角度看，VH3 only结合模式的分离选择性不再由Fc强亲和力主导，而是转向由VH3序列结合价态（binding valency）差异来驱动，从而显著降低了非目标物共捕获的风险，可被有效放大并转化为稳定、可预测的工艺分离机制。

MabSelect VH3的出现，补上了传统Protein A在结构选择性纯化方面的短板，为产品与副产物之间具有VH3结构域数量差异的复杂抗体分子提供了新的捕获策略。