小规模蛋白如何快速纯化和筛选？

7 月 31, 2023

在《Biacore耗材选择保姆级攻略，一次配齐安心上机！（上）》中我们分享了芯片和固定方法的选择以及相关实验方案，本篇智荟专线小编将继续分享Biacore实验流程中所要用到的耗材试剂，包括运行缓冲液、再生试剂、维护试剂的选择。

Mag Sepharose磁珠基于超顺磁技术，为典型的弥散性磁珠结构，由疏松多孔的琼脂糖基架和磁芯组成（图1）。磁珠粒径在37-100 μm之间，配基可以在整个空间结构内进行结合。多孔的特性增加了可用于结合的比表面积，大大增加了结合载量。用于在从细胞裂解物和生物体液中快速捕获和富集靶蛋白。Mag Sepharose磁珠产品可提供不同的配基种类，非常适用于中小型样品的制备、蛋白捕获和富集或免疫共沉淀 (Co-IP) 等应用。

图1：Mag Sepharose磁珠结构示意图

Mag Sepharose磁珠特点和优势

高结合力：较高的比表面积便于富集和结合靶蛋白。
高重现性：易于并行处理和筛选蛋白，非粘附性磁珠消除了拖影效应和聚集体形成现象。
快速高效：从μL至mL规模样本中轻松捕获靶蛋白，仅需少量抗体，即可优化靶蛋白的富集或免疫沉淀能力。
简单灵活：针对电泳和质谱 (MS) 分析，从小样品量到大样品量的自动化方案和洗脱条件，确保检测快速且易于重复。

Mag Sepharose磁珠种类

01Protein A Mag Sepharose & Protein G Mag Sepharose

Protein A Mag Sepharose和Protein G Mag Sepharose磁珠以琼脂糖凝胶为基架，分别以天然Protein A和Protein G为配体，对广泛物种来源的IgG抗体的Fc区具有高亲和力。可提供快速经典实验方案 (Classic protocol) 和交联实验方案 (Crosslink protocol) 两种不同的选择（图2）。

快速经典实验方案 (Classic protocol) 最终目标蛋白将会与抗体一起被洗脱，适用于偶联抗体不干扰下游的分析，需要更快的实验处理的应用场景。
交联方案 (Crosslink protocol) 只有目标蛋白被洗脱，而抗体通过使用交联剂保持与基质的共价结合，适用于目的蛋白/抗原与抗体的重链或轻链具有相似的分子量，从而导致SDS-PAGE分析中的共迁移问题。

图2：Classic protocol和Crosslink protocol流程示意图

02Protein A Mag Sepharose Xtra & Protein G Mag Sepharose Xtra

相较于Protein A Mag Sepharose & Protein G Mag Sepharose磁珠，Xtra系列磁珠拥有更高的结合载量，＞27 mg human IgG/mL。更高的结合载量可以高效捕获抗体，并达到高产量和高纯度的要求。用于对血清和细胞上清液中的单克隆和多克隆抗体进行快速、小规模的纯化及筛选。

取300 μL Human IgG作为spiked in加入到大肠杆菌裂解液中，并使用磁珠纯化（图3）。进行6次平行试验，结果发现抗体回收率＞80%，SDS-PAGE结果分析显示，六次重复运行得到的纯度在90%以上 (RSD<2%) 。

图3：SDS-PAGE分析显示两种磁珠纯化的抗体纯度均高于90％

03NHS Mag Sepharose

NHS Mag Sepharose为预活化的磁珠，与蛋白质、不同种类的抗体和诱导体等可以通过氨基进行共价偶联。NHS Mag Sepharose是血浆样品免疫沉淀的首选，因为内源性免疫球蛋白可能与Protein A Mag Sepharose或Protein G Mag Sepharose的剩余自由配体结合。

图4实验中使用小鼠单克隆抗体偶联NHS Mag Sepharose磁珠，并从血浆样品中富集纤溶酶原，实验结果可以看出，NHS Mag Sepharose相较于Protein A Mag Sepharose可实现更高水平目标蛋白纤溶酶原的富集。

NHS Mag Sepharose和Protein A Mag Sepharose的SDS-PAGE结果

图4：从人血浆中富集纤溶酶原。(A) NHS Mag Sepharose的SDS-PAGE结果。(B) Protein A Mag Sepharose的SDS-PAGE结果。箭头表示纯化的纤溶酶原的条带位置。

04Streptavidin Mag Sepharose

Streptavidin Mag Sepharose磁珠利用生物素与链霉亲和素（链酶亲和素配基固定在磁珠上）之间的强相互作用，可以简单高效地富集和纯化生物素标签蛋白，简化小规模纯化中的样品处理。

图5：六次重复纯化（3组平行实验）的回收率始终大于75%

05His Mag Sepharose Ni & His Mag Sepharose excel

His Mag Sepharose Ni磁珠，通过固相金属离子亲和层析 (IMAC) 快速小规模纯化和筛选来自不同来源的组氨酸标签蛋白质。His Mag Sepharose Excel磁珠同样基于IMAC，但镍离子非常牢固地结合至螯合配体上，因此可以耐受一定浓度的螯合剂（如0.1 mM EDTA），可用于直接捕获分泌到培养基中的表达蛋白，例如昆虫细胞或中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞等真核细胞分泌的蛋白，而无需进行过滤和浓缩。

为了验证His Mag Sepharose Excel磁珠纯化的灵活性，我们使用200 μL磁珠悬液纯化1 mL样本以及使用1 mL磁珠悬液纯化50 mL样本，将体系放大50倍，结果发现小规模纯化和大规模纯化的回收率和纯度相差不到10%，可实现不同体积样本的灵活纯化。

图6：SDS-PAGE分析显示His Mag Sepharose Excel纯化具有高回收率和高重现性。

Mag Sepharose最佳搭档-磁力架

磁力架是磁珠纯化中的必不可少的，Cytiva可提供从1.5 mL至50 mL不同纯化体积大小的磁力架，灵活满足小规模蛋白纯化和样本富集不同实验需求。

图7：MagRack 6磁力架

图8：Magnetic Separation Rack 15 mL

图9：MagRack Maxi

产品名称	包装规格	货号
Protein A Mag Sepharose	500 μL	28944006
Protein A Mag Sepharose	4×500 μL	28951378
Protein G Mag Sepharose	500 μL	28944008
Protein G Mag Sepharose	4×500 μL	28951379
Protein A Mag Sepharose Xtra	2×1 mL	28967056
Protein A Mag Sepharose Xtra	5×1 mL	28967062
Protein G Mag Sepharose Xtra	2×1 mL	28967066
Protein G Mag Sepharose Xtra	5×1 mL	28967070
NHS Mag Sepharose	500 μL	28944009
NHS Mag Sepharose	4×500 μL	28951380
His Mag Sepharose Ni	2×1 mL	28967388
	5×1 mL	28967390
	10×1 mL	28979917
	100 mL	29104065
His Mag Sepharose Excel	2×1 mL	17371220
	5×1 mL	17371221
	10×1 mL	17371222
Streptavidin Mag Sepharose	2×1 mL	28985738
Streptavidin Mag Sepharose	5×1 mL	28985799
MagRack 6	1	28948964
Magnetic Separation Rack 15 mL	1	29710714
MagRack Maxi	1	28986441