实例分享 | ÄKTA pure micro在单抗质控和Cryo-EM解析结构中的应用

ÄKTA pure micro专为小规模样品纯化、微量样品检测而打造，适用于蛋白、多肽、核酸等分子的分析检测，广泛用于生物制药、生命科学研究等领域。

为了帮助大家解决对微量纯化的需求，今天带大家一起了解ÄKTA pure micro在科研和工业的两个应用案例。

案例一：ÄKTA pure micro在单抗质控中的应用

挑战

在药物开发过程中，单抗易发生聚集，使产品的稳定性下降、不利于产品的存储，更甚者药物作用于人体将会引发不良反应而造成患者安全风险。

解决方案

生产过程中监测产品聚集水平，科学家通过优化生产策略有效降低聚集体含量。

凝胶过滤层析/分子筛（SEC）根据样品大小和形状对聚集体进行分离和检测，可用于量化和表征单抗聚集的情况。

单抗药物的另一个风险则是电荷异构体，也称电荷异质性。异构体可能由脱酰胺、氧化、糖化或C端赖氨酸剪切等翻译后修饰引起，会显著影响单抗的稳定性、药代动力学和免疫原性，因此需要对单抗进行全面表征。

离子交换层析（IEX）可以利用单抗电荷异构体之间的净电荷差异进行分离和定量。这些信息对于确保批次间的一致性和优化配方策略至关重要。

CHO细胞表达的单抗纯化方案：产品先通过MabSelect PrismA捕获，Capto S ImpAct离子交换填料进行精细纯化，每一步纯化后均进行层析分析用于组分合并和关键质量属性（CQA）分析。

实验设备、耗材与方法

抗体分子表达后经亲和纯化，收集组分通过分析型SEC评估聚集情况；亲和纯化的单抗再经离子交换层析纯化，收集组分通过分析型IEX测定聚集体含量和电荷异构体。

分析SEC层析：

使用ÄKTA pure micro系统和ALIAS自动进样器搭配Superdex 200 Increase 3.2/300层析柱进行聚集体分析；

分析IEX层析：

使用ÄKTA pure micro系统和ALIAS自动进样器搭配Capto HiRes S 5/50层析柱进行电荷异构体分析；

图1：实验流程和实验方法

实验结果

图2：分析型SEC的结果。UNICORN软件对峰积分以确定聚集体含量。亲和纯化后主峰聚集体含量为1-2%。

a）单抗纯化层析图。
b）亲和层析主峰的四个组分（起始、中间和结束部分）在ÄKTA pure micro系统SEC的检测结果。聚集体含量为1-2%。
c）分析型SEC色谱图的放大图像，主峰前的小峰代表聚集体。
d）亲和色谱主峰中每个组分的聚集体含量（%）。

图3：分析型IEX的结果。

a）IEX纯化的层析图。
b）IEX主峰三个组分进行分析，该峰通常包含片段、酸性、主峰和碱性变体。
c）变体（聚集体为蓝色，酸性为绿色，碱性为黄色）的分布和含量（%）显示在底部层析图中。

结合两步分析型SEC的检测结果，最终合并了115-125 mL之间的组分储存备用。结果显示经长期储存，可溶性单体单抗仍然是合并样品中的主要成分，聚集体、片段和电荷电荷异构体的含量较低。

案例小结：

本案例展示了使用ÄKTA pure micro系统结合ALIAS生物自动进样器评估单抗关键质量属性（CQA）的应用：

通过亲和色谱和离子交换层析纯化单抗，ÄKTA pure micro系统搭配自动进样器和Superdex 200 Increase 3.2/300、Capto HiRes S 5/50层析柱分别可以进行聚集体和电荷异构体的分析。

这些信息可以指导用户优化纯化策略，以获得聚集体、片段和电荷异构体含量较低的纯样品。同时分析SEC还可用于在储存后快速检查蛋白质样品的状态。

案例二：ÄKTA pure micro在Cryo-EM解析结构中的应用

挑战

冷冻电镜可以帮助科学家解析来自昆虫、哺乳动物重组甚至天然表达系统的产生的微量蛋白复合物的结构。这些复合物通常非常不稳定，这使得纯化过程具有挑战性。

结构解析时，研究人员需要将最终样品以约4 µL的小滴形式（浓度0.1 – 5.0 mg/mL）加到电镜网格中。

解决方案

为了避免样品在终末层析纯化步骤后发生聚集，应当尽量避免额外的浓缩步骤，因此选择小规模制备柱（如 Superdex Increase 3.2/300）和微量层析系统（ÄKTA pure micro）进行微量样品的纯化。

实验设备、耗材与方法

测试案例：

DNA结合蛋白复合物的体外重构；

层析系统：

ÄKTA pure micro与经典ÄKTA micro系统；

层析柱：

Superdex 200 Increase 3.2/300层析柱，使用30 µL进样环进样；

实验结果

将蛋白质I（180 kDa）、蛋白质II（32 kDa）和DNA在体外进行重构。结果显示主要吸收峰的保留体积基本相似，仅有一点细微差别。

两款ÄKTA系统都出色地将目标复合物（峰A2）与蛋白质杂质（峰B）和过量DNA（峰C）分离。目标复合物倾向于形成同源二聚体（峰A1）。单体与二聚体形成的动态平衡解释了峰A1高度的差异。目标组分（虚线框，峰A1）的电镜网格制备在显微照片上显示出均匀的样品分布和详细的2D类别。

ÄKTA pure micro操作非常简单，使用方法几乎与 ÄKTA pure系统相同。

特别的是，可以使用UNICORN软件灵活控制组分收集器F9-T，兼容不同的收集板，搭配微量收集滴头最小可实现按滴每管的收集（例如8uL/滴水的收集），适合微量样品，需要精细收集的蛋白结构解析实验。

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微量层析系统ÄKTA pure micro具有极小的内部体积，从UV检测器到组分收集器的延迟体积仅为18 µL，系统标配微量体积的阀门、微量体积检测器和极细连接管道，它拥有适合微量样品纯化的硬件参数和极佳实验表现。

与标准系统体积的ÄKTA相比，可显著提高实验的分辨率，如果您对微量纯化/检测有需求，欢迎跟当地的销售代表或技术支持取得联系！