单域抗体研究“多面手” ：Biacore助力对抗肉毒杆菌毒素

肉毒杆菌毒素（Botulinum toxin，BoNT）是一种由厌氧细菌产生的剧毒物质，会导致神经麻痹，目前没有官方批准的特效药。

单域抗体（sdAbs）由于其高亲和力、稳定性、溶解性和组织渗透性，被认为是对抗BoNT的很有潜力的候选药物。

2025年2月北京药理毒理研究所，首都医科大学附属北京友谊医院北京热带医学研究所等单位在《Heliyon》发表文章，报道了他们获得的一种针对肉毒杆菌毒素A（BoNT/A）的单域抗体（sdAbs）。

研究人员使用BoNT/A的受体结合域（BoNT/AHC_C）免疫双峰驼，构建了纳米抗体噬菌体文库。从文库中得到的抗体A1与BoNT/AHC_C具有高亲和力（KD=3.624E-10M，图1）。

图1：SPR检测抗体A1与AHCC的亲和力

研究人员通过竞争性实验来验证A1抗体是否能够阻止BoNT/A与SV2C（BoNT/A的受体之一）的结合。

在CM5芯片上固定SV2C，测定与BoNT/AHCC的亲和力为6.539E-8M（图2A），接着将A1抗体与BoNT/AHCC混合作为流动相，随着A1抗体浓度的增加，Ru值并没有减弱（如果A1抗体能够阻止BoNT/AHCC与SV2C的结合，那么随着A1抗体浓度的增加，BoNT/AHCC与SV2C的结合信号会减弱），反而增强了（图2B）。

这表明A1抗体并不能阻止BoNT/AHCC与SV2C的结合，进一步的分析表明，A1抗体结合到了BoNT/AHCC的非活性位点，远离SV2C的结合位点。

图2：SPR竞争实验测定A1抗体的中和能力

虽然A1抗体并不是一种能够中和BoNT/A的抗体，但研究人员利用A1抗体开发了一种间接筛选策略，即将A1抗体涂覆在免疫管上，利用A1抗体与BoNT/AHCC的高亲和力来捕获毒素，然后，加入噬菌体文库，使得噬菌体展示的VHH抗体有机会与BoNT/AHCC的活性位点结合，从而筛选出了能够有效中和BoNT/A的抗体。

接下来研究人员用SPR筛选阳性克隆，直接将Anti-M13固定在CM5芯片表面，与噬菌体反应从而将抗体捕获在芯片表面，然后进样BoNT/AHCC，用Stability报告点的响应值作为筛选标准，有8个克隆展现较高响应值（图3），进一步对这8个克隆进行Fc融合并在293T细胞中真核表达。

图3：SPR筛选中和抗体

利用Protein A芯片直接从表达的细胞上清中捕获抗体，将BoNT/AHCC作为分析物检测，克隆7展现出了高响应值和更慢的解离速率，将这一抗体命名为HM，纯化后检测与BoNT/AHCC的亲和力高达1.08E-11M（图4）。

图4：SPR筛选细胞上清（上）及表征纯化的抗体（下）

后续计算机模拟结果表明，抗体HM与AHCC结合的位点与SV2C相同，研究人员进一步用SPR验证了这一竞争结合的过程。

和之前A1抗体的表现不同，随着HM抗体浓度增加，Ru值下降，这表明HM抗体可以阻断AHCC和SV2C的结合（图5）。

图5：SPR竞争实验测定HM抗体的中和能力

随后的细胞实验也验证了HM抗体的中和活性，动物实验表明HM抗体能够保护小鼠免受BoNT/A中毒，是一种具有潜力的BoNT/A中和剂，可以用于预防和治疗肉毒杆菌中毒。

纵观整篇文章，HM抗体是通过间接筛选策略，从免疫双峰骆驼产生的噬菌体文库中成功分离得到的。

这种筛选策略强调了保持抗原的正确构象和暴露关键表位的重要性，为开发针对BoNT/A的特效药物提供了新的思路，而其中SPR技术在抗体筛选，亲和力表征，以及中和能力测定方面展现了“多面手”的强大实力：

细胞上清，噬菌体，纯化抗体，各种样品类型“通通拿下”
拥有mM-fM亲和力检测范围的Biacore，轻松测定A1/HM与AHC_C的亲和力
不仅是测定亲和力和筛选抗体的一把好手，还能研究抗体的中和能力