EMSA实验怎么做？ | 思拓凡学堂中国官网

EMSA实验介绍

EMSA实验又称凝胶迁移实验 (EMSA-electrophoretic mobility shift assay)，可以用于研究核酸 (DNA/RNA) 和蛋白质的直接相互作用，并在凝胶中进行可视化定性分析及定量分析。

EMSA实验原理

当核酸和蛋白质相互作用形成复合物时，其分子量会变大，通过SDS-PAGE胶的时间会变长。因此和未结合物相比，凝胶中通过标记的方法即可形成多个条带的表征。

HEX (green) – lablled DNA
TAMRA (red) lablled DNA
HEX (green) probe + Mnt protein
TAMRA (red) probe + Mnt protein
Mixtures
- 532 – nm excitation；555BP30 and 580BP30 emission filters.
- Imager – Amersham typhoon system

实验常见的标记物

同位素标记的探针

特点：特异性强、灵敏度高，但同位素半衰期短，对环境和对操作人员操作要求高；

地高辛或生物素标记的探针

特点：无需放射显影，采用生物发光或化学发光的原理，灵敏度高但需转印于膜显色检测，检测信号维持时间较短；

荧光探针

特点：无需膜转印或添加反应底物，直接对凝胶进行荧光成像检测，具有较宽的线性检测范围，灵敏度高，检测信号维持时间长；

因此目前常见的探针为荧光标记染料，如FAM。

EMSA实验怎么做？

1

样本制备

利用原核细胞过表达或者直接进行细胞蛋白提取。将超声破碎好的细胞液进行离心，12,000 rpm 4℃离心20 min。根据自身样本浓度建议各取适量蛋白加入SDS上样缓冲液，煮沸5 min进行制样

2

探针制备

根据购买的探针试剂盒的步骤进行核酸探针标记。（依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温 (20-25℃) 放置20分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，然后加入标记好的探针，混匀，室温 (20-25℃) 放置20分钟。最后加入EMSA上样缓冲液（无色），混匀后立即上样。尽量避免使用溴酚蓝，会影响蛋白和DNA的结合）

3

凝胶电泳

包括配胶或者预制胶，以及EMSA结合反应，进行分组设置EMSA结合反应（参考体系需根据样本蛋白浓度、结合强度进行预实验并进行调整）

4

转膜或者显色

5

如果使用生物素标记，需要转至和EMSA胶大小相近或略大的尼龙膜，并再进行下一步的交联反应，并使用Streptavidin-HRP试剂盒显色；如果使用荧光标记，则可以直接在凝胶中观察结果，无需转膜；如果进行同位素标记，则需转至尼龙膜上后使用磷屏压片进行放射自显影检测

6

成像

同位素标记法 - 使用放射自显影同位素成像设备Typhoon IP等；生物素法 - 使用紫外交联仪后再进行凝胶成像如IQ500、IQ800等；荧光标记法 - 使用多光谱激光分子成像Amersham typhoon等

EMSA实验作为转录调控以及基因表达研究中主流实验之一，对分子结合机制研究方面有杰出的体现，属于重要的基础分子实验之一。更多相关内容，欢迎扫码下载《Amersham Typhoon生物分子成像仪》。