EMSA实验怎么做?
EMSA实验介绍
EMSA实验又称凝胶迁移实验 (EMSA-electrophoretic mobility shift assay),可以用于研究核酸 (DNA/RNA) 和蛋白质的直接相互作用,并在凝胶中进行可视化定性分析及定量分析。

EMSA实验原理
当核酸和蛋白质相互作用形成复合物时,其分子量会变大,通过SDS-PAGE胶的时间会变长。因此和未结合物相比,凝胶中通过标记的方法即可形成多个条带的表征。


- HEX (green) – lablled DNA
- TAMRA (red) lablled DNA
- HEX (green) probe + Mnt protein
- TAMRA (red) probe + Mnt protein
- Mixtures
- 532 – nm excitation;555BP30 and 580BP30 emission filters.
- Imager – Amersham typhoon system
同位素标记的探针
- 特点:特异性强、灵敏度高,但同位素半衰期短,对环境和对操作人员操作要求高;
地高辛或生物素标记的探针
- 特点:无需放射显影,采用生物发光或化学发光的原理,灵敏度高但需转印于膜显色检测,检测信号维持时间较短;
荧光探针
- 特点:无需膜转印或添加反应底物,直接对凝胶进行荧光成像检测,具有较宽的线性检测范围,灵敏度高,检测信号维持时间长;
因此目前常见的探针为荧光标记染料,如FAM。
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样本制备
利用原核细胞过表达或者直接进行细胞蛋白提取。将超声破碎好的细胞液进行离心,12,000 rpm 4℃离心20 min。根据自身样本浓度建议各取适量蛋白加入SDS上样缓冲液,煮沸5 min进行制样
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探针制备
根据购买的探针试剂盒的步骤进行核酸探针标记。(依次加入各种试剂,在加入标记好的探针前先混匀,并且室温 (20-25℃) 放置20分钟,从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合,然后加入标记好的探针,混匀,室温 (20-25℃) 放置20分钟。最后加入EMSA上样缓冲液(无色),混匀后立即上样。尽量避免使用溴酚蓝,会影响蛋白和DNA的结合)
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转膜或者显色
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如果使用生物素标记,需要转至和EMSA胶大小相近或略大的尼龙膜,并再进行下一步的交联反应,并使用Streptavidin-HRP试剂盒显色;如果使用荧光标记,则可以直接在凝胶中观察结果,无需转膜;如果进行同位素标记,则需转至尼龙膜上后使用磷屏压片进行放射自显影检测
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成像
同位素标记法 - 使用放射自显影同位素成像设备Typhoon IP等;生物素法 - 使用紫外交联仪后再进行凝胶成像如IQ500、IQ800等;荧光标记法 - 使用多光谱激光分子成像Amersham typhoon等
EMSA实验作为转录调控以及基因表达研究中主流实验之一,对分子结合机制研究方面有杰出的体现,属于重要的基础分子实验之一。更多相关内容,欢迎扫码下载《Amersham Typhoon生物分子成像仪》。