手把手带你做实验｜分子筛层析：手动操作+方法设置，一篇吃透

3 月 19, 2026

在上期文章中，详细描述了层析实验前准备的完整流程，「手把手带你做实验」第二期，我们将以Superose 6 Increase 10/300层析柱为例，继续拆解分子筛层析的手动操作和方法设置，轻松搞定分子筛层析实验的操作过程，得到更好的层析结果。

一、实验前准备

详见 ➢ 手把手带你做实验｜实验前必看！ÄKTA层析实验前准备完整流程

二、分子筛层析的手动操作

保存手动运行的实验结果（关键！避免结果丢失）

很多人忽略这一步，导致实验结果被覆盖，白白浪费时间！划重点：系统默认将手动运行结果保存在「结果-Manual文件夹」，但该文件夹仅能保存10个结果，超过后会自动覆盖前序结果。

正确操作步骤：

点击工具栏Manual→Execute Manual Instructions在打开的Manual Instructions对话框中选择Save result as后的Browse按钮，选择要保存的路径及名称，点击OK。

图1 保存结果

层析柱平衡

2.1 设置压力报警：

点击工具栏Manual→Execute Manual Instructions→Alarm，根据层析柱参数，设置Alarm system pressure和Alarm pre column pressure（本案例均设为5 MPa），点击Insert；如有Alarm delta column pressure则根据填料耐压进行设置。

图2 设置压力报警

2.2 设置柱位与流向：

点击Flow Path→Column position，在下拉框选择柱子连接的位置；在Flow Direction复选框，选择溶液流向（一般选Down flow自上向下运行），点击Insert；如无柱位阀则无需进行设置。

图3 设置柱位和流向

2.3 设置运行流速：

点击Pumps→System flow，输入柱子推荐流速（如Superose 6 Increase 10/300推荐流速为0.5 mL/min），点击Insert→Execute。

图4 设置流速

2.4 设置监测波长：

点击Monitor→Wavelength，选择需要监测的波长，点击Insert→Execute；无需使用的波长，勾选后面的Off复选框关闭即可。（注意：单波长设备或仅需280 nm检测时，可跳过此步）。

图5 设置监测波长

2.5 平衡：

点击Execute，系统开始运行，层析柱进入平衡状态，此时Process Picture中会以绿色标识运行流路。

图6 实验运行界面

⚠️小提醒：平衡过程中，观察系统曲线，确保无异常波动，耐心等待平衡完成。

进样及洗脱

层析柱平衡期间，可提前准备上进工作，节省操作时间，步骤如下：

第一步：准备进样（平衡期间可同步操作）

3.1 在进样阀的LoopF和LoopE口，连接样品环(如0.5 mL)。
3.2 用注射器抽取缓冲液，连接到进样阀的Syr口，推入缓冲液清洗样品环，可重复几次，确保清洗彻底。
3.3 清洗完成后，用注射器吸取样品（重点：吸取的样品体积必须大于样品环体积）。
3.4 排除注射器内的气泡，将注射器连接到进样阀的Syr口，推入样品（重点：推入体积稍大于样品环体积，确保无气泡）。

⚠️注意：样品推完后，注射器仍需保留在进样阀上，不可取下，防止进气。

第二步：上样及洗脱操作

当系统所有曲线稳定，且电导、pH等参数符合平衡buffer条件，说明层析柱平衡完成。

3.5 点击Manual→Execute Manual Instructions→Monitors→Auto zero UV，点击Insert。

图7 紫外清零

3.6 点击Manual→Execute Manual Instructions→Flow Path→Injection valve，将进样阀选择为Inject，点击Insert。待进样完成后（根据流速和进样体积进行计算），将进样阀选择为Manual load，点击Insert，完成进样过程。

图8 插入Inject模式

3.7 点击Manual→Execute Manual Instructions→Fraction collector F9-R→Fractionation，设置Fraction size为1 ml，点击Insert。（此为固定体积收集示例）

图9 插入收集命令

3.8 点击Execute，系统开始上样及洗脱过程。

3.9 观察仪器界面，待紫外峰与电导峰均出现（走完约1.5 CV），点击工具栏中的结束图标，停止实验即可。

第三步：实验运行结束后需要清洗层析柱保存在 20%乙醇中

3.10 将缓冲液A1的入口放入去离子水中，执行Pump wash命令。点击工具栏Manual Execute Manual Instructions→Alarm, 分别设置Alarm system pressure和Alarm pre column pressure为5 MPa和5 MPa，点击Insert。

3.11 点击工具栏Manual→Execute Manual Instructions→Flow Path→Column position, 在下拉框中选择柱子需要连接的位置，在Flow Direction复选框中选择溶液流向Down flow或者是Up flow（一般选择Down Flow,自上向下运行），点击Insert；如无柱位阀则无需进行设置。

3.12 点击工具栏Manual→Execute Manual Instructions→Pumps→System flow, 输入层析柱推荐的流速为0.5 mL/min，点击Insert。

3.13 点击Execute一起执行相应的命令，即可开始用水清洗层析柱，运行2个柱体积之后，点击工具栏暂停图标，暂停。

3.14 将缓冲液A1的入口放入经脱气的20%乙醇中，继续运行，再次执行Pump wash命令。

3.15 待泵冲洗结束后，机器会自动继续之前0.5 ml/min的流速，用20%乙醇溶液清洗柱子，运行2个柱体积后，完成层析柱的保存。

三、分子筛层析的方法设置

真正发挥ÄKTA系统性能，让实验流程更加自动化、可重复、且贴合目标蛋白特性，合理编辑和设置方法是关键一步。为了让方法设置不再神秘，接下来我们将用非常直观的步骤，带你轻轻松松搞定如何在ÄKTA中创建方法设置。

打开Method Editor界面，点击Creat a new method图标（如下图），选择Predefined Method中下拉框选中Size Exclusion Chromatography(SEC)，点击OK。

图10 创建方法

分别对方法进行设置，根据Superose 6 Increase 10/300层析柱的说明书和实验的运行流程设置方法如下：

2.1 选中Phase Library中的Column CIP的模块，点击Insert插入到Method Phases中。

图11 插入方法模块

2.2 修改Method Settings中参数。选择Column Type中的Superose 6 Increase 10/300 GL，选择之后系统会自动出现该层析柱的Column Volume, pressure Limit pre- column, Pressure Limit delta- column, Flow Rate等参数。Column Position选择层析柱连接的柱位，如下图选择1号位。在Monitor setting处根据需求选择需要检测的紫外波长，系统默认使用280 nm检测，如需开其他波长（如260 nm），可勾选UV2，并输入相应波长即可。根据层析柱和设备的不同配置设置参数，如无柱位则无需设置。

图12-13 Method Settings界面

2.3 点击Equilibration进入平衡阶段设置，平衡流速、缓冲液入口不变，平衡时缓冲液B所占的比例为0%，输入平衡体积2 CV。

图14-15 Equilibration界面

2.4 点击Sample Application进入上样阶段设置，选择Loop type为Capillary loop，输入Empty loop with（清空样品环）的体积0.5 ml（此方法使用0.5 mLloop环，如使用更大体积Loop，需要增加Empty loop with的体积）。

图16 Sample Application界面

2.5 点击Elution进入洗脱设置，保持洗脱流速、缓冲液入口以及缓冲液流向不变。设置使用阶段洗脱1.5 CV，B浓度为0%，并在Fractionation Setting中选择Fraction Collector用收集器进行固定体积收集，每管收集1 mL。