单域抗体研究“多面手” :Biacore助力对抗肉毒杆菌毒素

单域抗体研究“多面手” :Biacore助力对抗肉毒杆菌毒素

单域抗体研究“多面手” :Biacore助力对抗肉毒杆菌毒素

肉毒杆菌毒素(Botulinum toxin,BoNT)是一种由厌氧细菌产生的剧毒物质,会导致神经麻痹,目前没有官方批准的特效药。

单域抗体(sdAbs)由于其高亲和力、稳定性、溶解性和组织渗透性,被认为是对抗BoNT的很有潜力的候选药物。

2025年2月北京药理毒理研究所,首都医科大学附属北京友谊医院北京热带医学研究所等单位在《Heliyon》发表文章,报道了他们获得的一种针对肉毒杆菌毒素A(BoNT/A)的单域抗体(sdAbs)。

研究人员使用BoNT/A的受体结合域(BoNT/AHCC)免疫双峰驼,构建了纳米抗体噬菌体文库。从文库中得到的抗体A1与BoNT/AHCC具有高亲和力(KD=3.624E-10M,图1)。

SPR分子互作系统检测抗体A1与AHCC的亲和力

图1:SPR分子互作系统检测抗体A1与AHCC的亲和力

研究人员通过竞争性实验来验证A1抗体是否能够阻止BoNT/A与SV2C(BoNT/A的受体之一)的结合。

CM5芯片上固定SV2C,测定与BoNT/AHCC的亲和力为6.539E-8M(图2A),接着将A1抗体与BoNT/AHCC混合作为流动相,随着A1抗体浓度的增加,Ru值并没有减弱(如果A1抗体能够阻止BoNT/AHCC与SV2C的结合,那么随着A1抗体浓度的增加,BoNT/AHCC与SV2C的结合信号会减弱),反而增强了(图2B)。

这表明A1抗体并不能阻止BoNT/AHCC与SV2C的结合,进一步的分析表明,A1抗体结合到了BoNT/AHCC的非活性位点,远离SV2C的结合位点

SPR分子互作系统竞争实验测定A1抗体的中和能力

图2:SPR分子互作系统竞争实验测定A1抗体的中和能力

虽然A1抗体并不是一种能够中和BoNT/A的抗体,但研究人员利用A1抗体开发了一种间接筛选策略,即将A1抗体涂覆在免疫管上,利用A1抗体与BoNT/AHCC的高亲和力来捕获毒素,然后,加入噬菌体文库,使得噬菌体展示的VHH抗体有机会与BoNT/AHCC的活性位点结合,从而筛选出了能够有效中和BoNT/A的抗体。

接下来研究人员用SPR筛选阳性克隆,直接将Anti-M13固定在CM5芯片表面,与噬菌体反应从而将抗体捕获在芯片表面,然后进样BoNT/AHCC,用Stability报告点的响应值作为筛选标准,有8个克隆展现较高响应值(图3),进一步对这8个克隆进行Fc融合并在293T细胞中真核表达。

SPR分子互作系统筛选中和抗体

图3:SPR分子互作系统筛选中和抗体

利用Protein A芯片直接从表达的细胞上清中捕获抗体,将BoNT/AHCC作为分析物检测,克隆7展现出了高响应值和更慢的解离速率,将这一抗体命名为HM,纯化后检测与BoNT/AHCC的亲和力高达1.08E-11M(图4)。
SPR分子互作系统筛选细胞上清(上)及表征纯化的抗体(下)

图4:SPR分子互作系统筛选细胞上清(上)及表征纯化的抗体(下)

后续计算机模拟结果表明,抗体HM与AHCC结合的位点与SV2C相同,研究人员进一步用SPR验证了这一竞争结合的过程。

和之前A1抗体的表现不同,随着HM抗体浓度增加,Ru值下降,这表明HM抗体可以阻断AHCC和SV2C的结合(图5)。

SPR分子互作系统竞争实验测定HM抗体的中和能力

图5:SPR分子互作系统竞争实验测定HM抗体的中和能力

随后的细胞实验也验证了HM抗体的中和活性,动物实验表明HM抗体能够保护小鼠免受BoNT/A中毒,是一种具有潜力的BoNT/A中和剂,可以用于预防和治疗肉毒杆菌中毒

纵观整篇文章,HM抗体是通过间接筛选策略,从免疫双峰骆驼产生的噬菌体文库中成功分离得到的。

这种筛选策略强调了保持抗原的正确构象和暴露关键表位的重要性,为开发针对BoNT/A的特效药物提供了新的思路,而其中SPR技术在抗体筛选,亲和力表征,以及中和能力测定方面展现了“多面手”的强大实力:

  1.  细胞上清,噬菌体,纯化抗体,各种样品类型“通通拿下”
  2.  拥有mM-fM亲和力检测范围的Biacore分子互作系统,轻松测定A1/HM与AHCC的亲和力
  3.  不仅是测定亲和力和筛选抗体的一把好手,还能研究抗体的中和能力
如何加速细胞株开发,有效提升双抗精准筛选?

如何加速细胞株开发,有效提升双抗精准筛选?

如何加速细胞株开发,有效提升双抗精准筛选?

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在抗体药物与诊断原料研发前期,高通量抗体效价测定对于高效的细胞系开发 (CLD) 过程非常重要。对于工作流程早期的效价筛选,单个细胞株样品量少,表达丰度低,尤其是双特异性抗体(Bispecific Antibody,bsAb,后简称为双抗)其研发过程会存在大量由于错误组装产生的产品相关杂质。

在筛选的时候,不仅需要筛选出能高效表达大量双抗的细胞株,还要找到那些产生正确组装双抗的细胞株。因此,此类抗体的细胞株开发较为复杂。筛选出稳定高产的细胞株可以降低开发成本、提升生产效率与产品质量。

所以有什么技术可以实现这样的高通量抗体效价测定呢?

Biacore提供了一种低样本消耗、高灵敏度、高效及无人值守的解决方案,能够在短时间内(8至10小时)评估多个96孔板的抗体效价,而且检测动态范围广。在双抗细胞株开发中,利用Protein A芯片进行滴度测定+三明治法,可以同时评估双抗的克隆表达水平及纯度。

接下来,我们将一起探讨,Biacore 8K+是如何筛选出高性能的CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)。

01

材料与方法

材料:CHO-K1细胞系,培养阶段:静态板阶段及摇动深孔板阶段。

表1:产品信息

方法:

 

抗体效价测定:在静态板培养阶段,通过Protein A结合法直接测量抗体效价,筛选出表达良好的细胞株,实验方案如下图1a所示。

图1a
正确配对的双抗测定:在振荡深孔板阶段,除了Protein A结合法外,进一步使用包含CD3和一种类蛋白L肽结合的夹心测定法来检测双抗是否正确组装,实验方案如下图1b所示。

图1b
IgG测量:使用Cedex-Bio分析仪测量IgG以确认总抗体效价。

LC-MS验证:使用LC-MS以确认bsAb配对。

HPLC验证:通过MabSelect VL补料分批培养物进行纯化,并使用HPLC验证bsAb的组成。

02

结果

在细胞株开发 (CLD) 的不同过程中,研究人员成功地使用了Biacore 8K+系统的Protein A测定法(图2–4)和夹心测定法(图3–4),进行抗体效价筛选,以挑选出具有正确组成的双抗及高表达双抗的细胞株。在分析时,以正确形式双抗/总抗体表达量的比例做为选择依据。

图2:从20个静态培养阶段96孔板中进行首次筛选出的总抗体效价
图3:振荡深孔板培养阶段的96深孔板中筛选的总抗体效价和正确组装的双抗
图4:筛选出7个克隆进行滴度筛选,在摇瓶中进一步培养。使用Biacore进行蛋白总Ab滴度和正确bsAb组装分析。总Ab滴度使用Cedex-Bio IgG测定法测量
图5:用PreDictor MabSelect PrismA板纯化这七个克隆,通过LC-MS确认正确配对和错误配对的bsAb的数量
图6:通过HPLC分析验证MabSelect VL纯化后的7个克隆的双抗组成

Biacore SPR系统所得数据与LC-MS数据及纯化数据的高度一致性,印证了该系统的可靠性与准确性。Biacore 8K+ SPR系统在细胞株开发过程中扮演着至关重要的角色,特别是在双特异性抗体(双抗)生产细胞株的早期表征与筛选阶段,它提供了一种新颖的、快速的检测方法。Biacore SPR系统能够高效地识别并筛选出高产且组成正确的双抗克隆,从而极大地促进了研发进程。

  • Biacore以其低样品消耗和高检测灵敏度等特性,在早期细胞株的正确鉴定中展现出显著的优势。
  • Biacore具有出色的样品兼容性,能够从容应对粗样品的检测挑战。
  • Biacore系统内置了浓度定量和分析模块,能够提供稳定且高度重复的检测结果。
  • Biacore的芯片允许多次再生使用,极大降低了每个样品的检测成本,使其低于1元。

这些特点使得Biacore成为生物分析领域中不可或缺的工具,其应用伴随着生物技术的发展也在不断扩展。为科研和药物开发提供了强有力的支持。

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IL-17赛道大爆发,明星药企都用Biacore做了啥?

IL-17赛道大爆发,明星药企都用Biacore做了啥?

IL-17赛道大爆发,明星药企都用Biacore做了啥?

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2024年8月27日,NMPA批准恒瑞夫那奇珠单抗和智翔金泰赛立奇单抗用于中重度斑块状银屑病的上市申请,国产单抗姐妹花一举打破IL-17赛道长期被进口产品垄断的局面。回顾IL-17生物药研发历史,无论是诺华、礼来等MNC,还是本土Pharma、Biotech企业都使用Biacore进行了广泛的应用。接下来简举几个案例,一睹各大企业的应用思路。

01

诺华Secukinumab

2015年Secukinumab作为全球首款获批的IL-17A单抗用于银屑病,并于2018年获得CFDA批准开启了中国银屑病治疗的白介素时代。根据披露资料显示,在苏金单抗的研发中,Biacore被用于药物分子与靶点IL-17A的亲和力和动力学测定,比较不同生产工艺对产品质量的影响。Table 5结果显示Sp2/0细胞表达的抗体亲和力,Table 6结果显示CHO细胞表达的抗体亲和力。

02

礼来Ixekizumab

Ixekizumab在2016年获得FDA批准上市,用于银屑病的治疗。Ixekizumab针对IL-17A具有较高的亲和力和特异性,抑制IL-17A与IL-17受体的结合。在Taltz研发中,Biacore用于检测药物与靶点IL-17A的亲和力和动力学数据 (Table 1) ,比较了Taltz与不同种属来源的IL-17A的亲和力差异。Biacore数据表明:相较于兔,Ixekizumab与人和猴种属的靶点亲和力更强。此外,Biacore还被用于药理学作用研究,通过Biacore竞争实验设计,直接揭示了Taltz的药理途径是阻断了IL-17A与IL-17受体结合 (Figure 2) 。

03

智翔金泰Xeligekimab

Xeligekimab (GR1501) 作为全人源IgG4类型抗体,其作用机理是通过抗体特异性结合血清中的IL-17A蛋白,阻断IL-17A与IL-17RA的结合,抑制炎症的发生和发展。通过披露数据显示,研发人员使用Biacore检测了Xeligekimab与同源二聚体靶点IL-17A及异源二聚体靶点IL-17A/F的亲和力,结果显示二者亲和力高度相似,分别为0.139 nM和2.47 nM。

04

华奥泰HB0017

HB0017是由华奥泰研发的一种新型抗IL-17A抗体,其在与IL-17A结合时表现出更广泛的交叉反应性的抗体,并且具有高亲和力。研发人员首先应用Biacore发现HB0017与人源靶点具有高亲和力,KD=2.73 pM。此外,与Secukinumab和Ixekizumab不同,HB0017表现出更广泛的交叉反应性的抗体,特别是在鼠源结合上明显不同(后两者不结合)。
同时,通过ELISA与Biacore检测显示,HB0017只能够与IL-17A和IL-17A/F结合,与IL-17B–F亚型均不能结合。
IL-17靶点作为MNC、本土Pharma、Biotech企业激烈竞争的赛道,为何他们一致将Biacore作为药物与靶点的亲和力检测的手段呢?究其原因,大致归于以下两点原因:

 1 

药物高亲和力与Biacore宽检测限的契合

IL-17单抗药物亲和力达到pM级别,kd达到E-5 s-1级别,这是检测其亲和力的难点之一。Biacore检测限可达fM级别,kd达到E-6级别s-1,完全满足检测需要。如此宽的检测范围是同类型设备无法做到的。

 2 

药物慢解离与Biacore超高基线稳定性的契合

IL-17单抗药物慢解离是检测亲和力的难点之二。Biacore的基线漂移可达< 0.03RU/min,搭配纯金材质的芯片,保证了足够的检测稳定性。这么高的基线稳定性也只有Biacore能够做到。

未来IL-17赛道将成为药企激烈竞争的赛道,谁掌握了最好的研发手段,谁就能够获得最佳的药物分子,引领江湖。而Biacore作为分子互作检测的“金标准”,已经得到了国内外药企的一致认可,相信在IL-17的赛道上,Biacore将会助力更多优秀产品的上市,造福人类。

Biacore,

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双抗分子如何开展效价测定,使用Biacore就对了

双抗分子如何开展效价测定,使用Biacore就对了

双抗分子如何开展效价测定,使用Biacore就对了

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重组蛋白、疫苗、血清等样品的效价测定工作,想必大家都不陌生啦。小编团队此前也整理了诸多案例及实验方案解读及介绍,详情见:

☞ 效价测定知多少,SPR技术把你教

不止测定亲和力!Biacore让你轻松测定各类分子浓度

今天,就让我们聚焦于双抗分子,看看如何针对双抗分子展开高效的效价测定工作!

罗氏制药收购的基因泰克公司于2022年1月28日宣布,FDA已批准使用Vabysmo (faricimab-svoa) 治疗湿性或新生血管性年龄相关性黄斑变性 (nAMD) 、糖尿病性黄斑水肿 (DMF) 、视网膜静脉阻塞 (RVO) 患者,它是首款获FDA批准用于眼部的双特异性抗体

早在2014年,罗氏研发中心就围绕faricimab展开了其效价测定方案的研发工作。接下来,让我们重温经典,一起来看看具体的实验设计及数据吧!

01

实验设计

芯片:CM5

实验步骤:捕获法(偶联VEGF蛋白;抓取不同浓度的双抗,60 s;接着进样Ang-2抗原,30 s,1 μg/mL)

方法模板:连续进样模式

实验流速:5 μL/min

缓冲液:HBS-N(偶联);PBS-T(运行)

再生液:10 mM Gly,pH=2.0

图1:使用Biacore搭建faricimab的效价测定方案

02

实验结果

01

确定faricimab的进样条件及数据分析模型

在图1实验方案中,R1数值代表了faricimab针对VEGF的结合活性,而R2信号值取决于结合在VEGF芯片上的双抗数量及真实活性。

为探究faricimab在此效价测定方案中的浓度依赖现象,研究人员在Injection 1中,选择上样0.35 μg/mL-30 μg/mL的双抗,Injection 2中的Ang-2抗原保持30 s,1 μg/mL的实验参数,结果如图2所示,R2信号随着faricimab的进样浓度增加呈S曲线趋势,当faricimab的进样浓度高于10 μg/mL时,R2信号呈负增长趋势。因此,在后续的实验中,faricimab的进样浓度低于10 μg/mL。

为探究precision、accuracy、linearity与specificity等性能参数,研究人员选择了slope-ratio、parallel-ratio模型进行了数据采集及分析工作。同时,也选择了parallel line model进行数据采集及分析,具体见图3。

图2:Faricimab在不同浓度条件下时,R1/R2信号的变化情况

图3:R2的浓度依赖情况(A: Parallel line model; B: Slope-ratio model)

02

验证方案的适用性及特征参数

研究人员使用了60-140%活性浓度的标准品,测试了此实验方案的linearity、accuracy、precision等参数,具体数据如表1。

表1:60-140%活性浓度的标准品测定得到的特征参数结果

在文章中也提及了faricimab双抗是由VEGF、Ang-2特异性抗体组成的,所以研究人员也分别用单型亲本抗体进行了特异性测试,也设置了不同的处理条件(例如pH、温度),探究不同抗体的活性变化情况,结果见图4。看图可以发现单型亲本抗体或同型对照相较参考品,均没有信号响应,而经过处理后的抗体的活性则有不同程度的降低,即可充分证明此效价测定方案具有强特异性。

图4:抗体在不同条件下的活性检测情况

在此篇方法开发类文章中,我们看到了诸多流程示意图及实验图谱。研究人员搭建的效价测定方案中,采用了最佳的实验参数及数据分析模型。最终线性相关性R2=0.9997,准确性97%,偏差2%。

相较传统的终点检测法(例如ELISA),Biacore在开展相关实验方案的制定时采用了在线测量方式,无需把实验分割成多步实验去完成,减少了可变量因素。同时,Biacore采用了label-free检测方式,检测信号与芯片表面质量的变化呈正相关关系,所以无需对检测样本做预标记处理,降低了实验复杂度及样品消耗。

看完以上内容,不由觉得Biacore应用面颇广呀。例如蛋白、多抗、核酸、多糖、病毒颗粒等,Biacore都能助力相关的检测方案建立,助力研发成果的转化,加速药物的上市进度。大家如若对Biacore设备应用进展或对实验方案设计有特定的需求,欢迎随时与我们联系!

新型双特异性抗体Zanidatamab结构设计及活性验证思路

新型双特异性抗体Zanidatamab结构设计及活性验证思路

新型双特异性抗体Zanidatamab结构设计及活性验证思路

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自拉罗替尼与恩曲替尼问世以来,广谱抗癌呈现千帆竞发的趋势。Zanidatamab作为大分子类药物的明星代表,先后获得FDA给予的孤儿药认定,快速审批认定,突破性疗法认定,成为双抗药物领域“最亮的崽”。

近期,Zymeworks公司发表文章《An anti-HER2 biparatopic antibody that induces unique HER2 clustering and complement-dependent cytotoxicity》(图1),详细阐述了Zanidatamab的研发思路。其中,Zanidatamab结构设计活性验证思路之灵巧,值得我们借鉴,接下来我们一睹为快。

图1:文章首页截图

01

Zanidatamab结构设计

研发人员依托于Azymetric Fc平台,设计出靶向HER2-ECD4的scFv及靶向HER2-ECD2的Fab的双抗(图2)。其中针对前体抗体的检测,以“单价单臂”抗体形式 (OAA) ,借助于Biacore,检测得到亲和力分别为1 nM和15 nM(表1)。
图2:Zanidatamab结构示意图
表1:Expression yield, DSC melting temperature, Equilibrium Dissociation Constant (KD) , and Kinetic Rate-Constants for One-Armed Antibody (OAA) Constructs

02

结构改造,提升亲和力,增强靶点交联

双抗诱导靶点交联可以增强受体驱动型内吞及受体下调,研究人员构建计算动力学模型(图3),并计算出提升靶向HER2-ECD2 Fab亲和力将最大程度增强靶点交联。研发人员随即设计出一系列突变,并以OAA形式使用Biacore进行筛选,最终获得亲和力增强8倍的Fab(表1),使得Zanidatamab与人HER2亲和力达到0.74 nM(表2)。

图3:计算动力学模型
表2:Equilibrium Dissociation Constant (KD) and Kinetic Rate Constants of Zanidatamab Binding to Recombinant Human HER2 ECD by SPR

03

验证结合机制,确认cis/trans结合模式

为了验证Zanidatamab与HER2-ECD的结合机制并获得关于cis/trans受体结合能力信息,研发人员首先归纳出单/双抗与HER2结合的类型(图4)。接下来,研发人员借助Biacore,在芯片表面偶联不同密度抗体,以koff值进行验证(图5)。

Trastuzumab不会因抗体偶联密度而改变koff值;

前体Zanidatamab及Zanidatamab若以cis形式结合,则koff值也不会改变;

前体Zanidatamab及Zanidatamab若以trans形式结合,则koff值变小。

图4:单/双抗与HER2结合模式

图5:Biacore实验设计思路

最终,Biacore实验结果显示,Trastuzumab koff值不变,前体Zanidatamab及Zanidatamab的koff值变小,确认受体trans结合模式(图6),该结果与超速离心、电镜实验结果相互印证。

图6:Biacore实验动力学数据

Zanidatamab在细胞模型、动物模型、临床试验上的优异表现得益研发人员精巧的结构设计及后期活性验证。而Biacore凭借数据精准可靠平台灵活易用,成为研发人员最重要的技术手段。相信在广谱抗癌的潮流中,Biacore将助力更多明星药物,普惠亿万受众。

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尊嘟假嘟,巨细胞病毒抗体研究有它就够了

尊嘟假嘟,巨细胞病毒抗体研究有它就够了

尊嘟假嘟,巨细胞病毒抗体研究有它就够了

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人巨细胞病毒 (HCMV) 是一种双链DNA β-疱疹病毒,在免疫功能低下的个体中CMV可引起严重的并发症,危及生命。HCMV利用特定的糖蛋白复合物(如gB和gH/gL)来介导病毒对宿主细胞的附着、融合或内吞。gH/gL/gO异源三聚体与血小板衍生生长因子受体α (PDGFRα) 的互作介导病毒进入成纤维细胞和上皮细胞,五聚体gH/gL/UL128/UL130/UL131A与神经母细胞素-2 (Nrp2) 结合,启动上皮细胞的病毒内吞作用。

目前仍然没有批准的预防性疫苗或治疗药物用于临床HCMV感染,因此需要扩大预防和治疗解决方案,以更充分地控制免疫功能低下个体的HCMV感染。到目前为止,虽然CMV疫苗和化学药物对HCMV有效,但受到化学药物的毒性、耐药性以及血液来源产品缺陷的严重限制。基于单克隆抗体的治疗是一种有效的临床替代方案,具有克服现有药物局限性的优点。

暨南大学生命科学与技术学院廖化新课题组Microbiology Spectrum上发表文章,报道了从HCMV阳性的健康志愿者血液中分离得到的8个单克隆抗体,其中,抗体PC0012、PC0014、PC0035、PC0037、PC1和PC109结合五聚体和三聚体;抗体PC0031和PC0034仅与CMV五聚体结合,而不与三聚体结合。

抗体活性表征

为了验证这些中和抗体与三聚体和五聚体的结合亲和力,研究者选择表面等离子体共振 (SPR) 技术对分离得到的抗体与已知中和抗体MSL-109的结合亲和力进行了比较。

结果表明,PC0012、PC0014和PC0035结合五聚体的亲和力KD分别为2.85×10−10 M、3.23×10−10 M和1.83×10−10 M,结合三聚体的亲和力KD分别为9.38×10−11 M、1.00×10−9 M和1.01×10−10 M。与五聚体的结合亲和力相比MAb MSL-109高出约4-7倍,与三聚体的亲和力比MAb MSL-109高约20-230倍(图1A和B)。

图1:Biacore测定PC0012、PC0014和PC0035,以及对照MAb MSL-109结合五聚体 (A) 或三聚体 (B) 的亲和力动力学

抗体竞争阻断分析

为深入了解MAbs PC0012、PC0014和PC0035识别的抗原表位与已知中和抗体MSL-109的关系,研究人员选用ELISA和Biacore实验进行抗体竞争阻断分析。

然而ELISA实验中,研究者没有发现组1中MAbs与组2中的MAbs竞争结合,反之亦然。

图2:Biacore测定PC0012、PC0014、PC0031、PC0034、PC0035、PC0037,以及对照MAb MSL-109、9I6和BI21的竞争阻断关系

Biacore抗体竞争阻断分析实验中使用人抗体捕获试剂盒将Anti-human Fc固定在CM5芯片表面作为捕获分子,依次检测抗体与HCMV五聚体或三聚体的结合。结果表明,PC0012阻断了PC0014和PC0035与CMV五聚体的结合,而PC0014仅部分阻断,PC0035完全不阻断PC0012与CMV五聚体的结合。PC0014和PC0035没有阻断对方与CMV五聚体的结合(图2)。

中和抗体MAb 9I6识别五聚体特异性位点5并阻断CMV五聚体与细胞表面受体Nrp2的结合。在与CMV五聚体的结合强弱上,PC0034结合亲和力KD为1.05×10−10,而MAb 9I6与五聚体结合的亲和力略低,仅为4.84×10−10M。MAb PC0034完全阻断MAb 9I6与CMV Penamer的结合,反之亦然(图3)。

图3:Biacore测定PC0034以及对照组9I6结合五聚体的亲和力动力学及竞争阻断关系

抗体P0034的抗原表位鉴定

随后,研究者解析了五聚体的复合物晶体结构,结合突变实验用Biacore验证结合的关键性氨基酸。结果显示,PC0034与五聚体突变体UL131A_E23A、UL131A_K27A、UL128_K47A和UL128_T94A的结合显著降低。其中,突变体UL128_T94A和UL131A_K27A的亲和力分别降低约81倍和约34倍,对PC0034与五聚体的结合具有最强的影响,Biacore证明五聚体上UL128亚基的T94和UL131A亚基的K27是PC0034识别的关键表位相关残基。
图4:通过五聚体突变体找到PC0034结合的关键位点

回顾整篇文章,研究者在取得志愿者血液样品后,使用Ficoll-Paque PLUS分离外周血单核细胞 (PBMC) ,通过流式细胞术 (FACS) 和RT-PCR,借助ÄKTA分离纯化 8个抗体。

使用Biacore表征了这8个单克隆抗体与五聚体、三聚体的结合活性,并且与已知中和抗体MSL-109和9I6的结合活性进行比较以及进行抗体间竞争阻断分析。对于结合五聚体但无中和能力的抗体PC0034,通过纯化共结晶解析了复合物的晶体结构,分析互作的关键位点,使用Biacore验证了关键位点对于相互作用的影响。

总的来说,在抗体活性表征,竞争阻断分析,关键结合位点分析中,Biacore均提供了核心数据。

自1990年上市以来,Biacore作为中美日药典收录的分子互作检测“金标准”,在基础科研与药物开发的多个领域广泛应用。其卓越的性能和准确的数据分析,使其成为产学研的得力助手。截至目前,借助Biacore累计发表的文章已近60000篇,特别值得一提的是,超过85%的已上市抗体药物的研发、申报和生产过程中都有Biacore的身影。这表明Biacore在药物开发领域的重要作用,其在药物研发过程中的可靠性和高效性得到了广泛认可。随着科技不断进步和Biacore技术的持续发展,可以有信心预见,未来中和抗体药物研发领域将迎来更大的突破。