两会期间，“树立大食物观”的观点被提出，水果是食物保障中的重要内容。中国的苹果年产量4406.6万吨（2020年），占全球苹果产量的近一半，常见的苹果品种也有几十种之多。超市里的苹果有红有绿还有黄，顾客关注哪个苹果好吃，而中国农业大学的研究团队则一直在盯着苹果果皮：它是怎么变色的？

苹果变红包括叶绿素降解（褪绿）和花青素积累。早在2018年，韩振海、吴婷老师团队发表在《Plant Physiology》的研究成果中，就发现乙烯响应因子ETHYLENE RESPONSE FACTOR17 (MdERF17)通过结合褪绿相关基因PPH、NYC的启动子来调控褪绿过程，其中Biacore提供了MdERF17与启动子结合的关键信息。近期文章中，作者首先利用免疫印迹法鉴定出与MdERF17相互作用的激酶MAP KINASE4（MdMPK4），利用Biacore T200，将MdMPK4固定在CM5芯片上，使MdERF17流过芯片表面检测动力学/亲和力，结果明确了MdMPK4-06G/14G与MdERF17-8s/3s的相互作用（图1）。

图1 Biacore检测MdMPK4与MdERF17的结合能力

随后作者利用免疫印迹和LC-MS发现MdMPK4-14G可以在Thr67位点磷酸化MdERF17-8s，而MdMPK4-06G则不能，这为后续昼夜调控的研究埋下了伏笔。沿着前文研究的信号通路，作者设计了以MdMPK4-14G和MdERF17为效应子，以PPH-LUC、NYC-LUC为报告基因来检测体内的互作，发现只有在MdERF17受MdMPK4-14G磷酸化后才会激活下游PPH、NYC的转录。

为了进一步研究这一机制对叶绿素降解的调节，作者比较转入了空载或MdERF17的苹果果实，发现转入MdERF17的果实中PPH、NYC表达水平升高，叶绿素含量降低，且这一现象仅在MdERF17能被磷酸化的一组中出现，说明MdERF17的磷酸化促进了叶绿素的降解。

研究团队之前的文章中利用Biacore发现ERF17基因重复编码区，丝氨酸残基增多，对下游叶绿素降解相关基因PPH、NYC启动子的结合能力和稳定性也随之增强（图2）。本文同样利用Biacore研究了不同长度丝氨酸的影响，在Biacore结果发现MdERF17-8S与MdMPK4的亲和力更强（表1）之后，作者选择了MdERF17-3S纯合子的紫塞明珠和MdERF17-6S/8S的红富士，发现果实成熟期间叶绿素降解与MdERF17磷酸化呈现正相关的关系，进一步说明MdERF17重复编码区中丝氨酸个数与其磷酸化和下游叶绿素降解的关系。

图2 Biacore检测发现ERF17中重复丝氨酸的数量影响与下游启动子的结合能力

表1 Biacore 测定MdERF17与MdMPK4的动力学参数

聊完了MdERF17，继续关注上游的激酶MdMPK4。前面提到，MdMPK4-14G可以磷酸化MdERF17，而MdMPK4-06G则不能。作者进一步比较MdMPK4-14G和MdMPK4-06G启动子上游的基因序列后，发现MdMPK4-14G独有一个昼夜节律相关的原件。由此团队研究了白天和夜晚时MdMPK4-14G的表达水平，蛋白丰度及MdERF17的磷酸化水平，发现MdMPK4-14G是个不折不扣的夜猫子！不仅在晚上表达水平高，蛋白丰度高，引起的MdERF17的磷酸化程度也更高。作者对嘎啦苹果过程成熟中进行持续暗处理，发现MdMPK4-14G直接参与黑暗条件下叶绿素的降解。

图3 黑暗条件下MdMPK4-14G的表达水平和磷酸化能力提高

至此，脉络逐渐清晰起来。基于大量的研究成果，作者提出了一个调控苹果变色的模型（图4）。晚上黑暗条件下，MdMPK4-14G带领着下游分子工作，降解叶绿素，给苹果褪绿，白天光照时，MdMPK4-14G休息，轮到MdMPK4-06G上场，积累花青素给苹果着红色。生物分子受光调节，同心协力，才结出了红的黄的绿的苹果，地球日过去不久，希望大家一直珍惜粮食呀！

图4 苹果果实中MdMPK4-14G介导的MdERF17磷酸化调控叶绿素降解

植物学的研究总是厚积薄发，并且关系着农业、食品、环境、药物等等，哪一个都与我们的生活息息相关。从生长发育机制到抗逆，从天然活性成分的发现到农残检测，Biacore一直全力支持着植物学研究者。劳动节刚刚过去，北方夏收即将到来，在这里祝农民朋友，科技工作者，参与粮食生产的每一位劳动者丰收！

越来越多的PI3Kα抑制剂在临床试验上取得突破性进展，但目前可用的PI3Kα小分子抑制剂不能区分野生型蛋白 (WT) 和癌突变体蛋白，因此它们同时也会抑制WT酶维持基本生命的活性，带来的高毒性等副作用，使其成为应用于临床所面临的巨大挑战。因此，识别突变体特异性位点，并基于此位点进行药物设计至关重要。

023年下半年，复旦大学基础医学院王明伟讲席教授、美国Scripps研究所Peter K. Vogt院士和中国科学院上海药物研究所杨德华研究员合作在《美国国家科学院院刊》上发表了题为“Structural insights into the interaction of three Y-shaped ligands with PI3Kα”的研究成果（图1），研究人员通过冷冻电镜分别解析了PI3Kα与三种Y型配体（Cpd16、Cpd17和Cpd18）复合物的结构，并用Biacore的亲和力结果与之相互验证，揭示了之前未曾报道的特殊配体结合口袋（空间上靠近ATP结合位点），为靶向PI3Kα的药物设计提供了新的思路。

图1：复旦大学和中科院上海药物所等发表在PNAS上的科学研究论文

Biacore助力PI3Kα相关研究

首先，他们分析了Cpd17–PI3Kα的冷冻电镜结构，结果显示Cpd17以Y型构象结合在PI3Kα上，其中一条侧链（2,3-二甲基喹喔啉-6-羧酰胺）插入到先前未知、由R770和W780形成的“三明治”型口袋，形成强烈的π-π和cation-π相互作用；另一条侧链（6-(2-苯基乙炔基)喹喔啉）则以独特角度插入ATP结合位点，与PI3Kα形成丰富的疏水和堆叠作用。进一步，研究人员通过Biacore实验验证了Cpd17与PI3Kα的强亲和力，二者的亲和力K_D高达347 nM（图2）。

图2：Biacore检测PI3Kα与Cpd17的亲和力以及PI3Kα-Cpd17复合体的冷冻电镜结构

cpd16是cpd17的S型对映异构体，Cpd16的手性差异使得其氨基酸尾部旋转以致略微远离PI3Kα，从而减少了与后者相互作用之面积，降低了二者的亲和力。Biacore结果与之完全一致，Cpd16与PI3Kα的亲和力稍微降低，降低了约3倍，是915 nM （图3）。cpd18是cpd17的间异构体，Cpd18的苯环间位取代使Y型中心叔碳往远离P-环方向位移2.5 Å，引起6-（-苯基乙炔基）喹喔啉和2,3-二甲基喹喔啉-6-羧酰胺分别旋转67.6度和27.4度，因此无法与S773和V851等形成氢键，与R770的堆叠和M772的疏水作用也明显下降，由此显著下降了同PI3Kα的亲和力。Biacore结果与之完全一致，相较于Cpd17与PI3Kα的亲和力，Cpd18与PI3Kα的亲和力显著降低，降低了约28倍，只有9930 nM（图3）。对于三种不同亲和力的Y型配体（Cpd16、Cpd17和Cpd18）复合物的深入研究，阐明了立体或区域化学修饰引起亲和力差异的结构基础，为靶向PI3Kα的药物设计提供了新的思路。

图3：Biacore检测PI3Kα与Cpd16、Cpd18的亲和力

小结：

作为冷冻电镜的黄金搭档，Biacore还将持续助力更多结构的解析以及结构生物学的发展。不仅在结构生物学与药学领域，Biacore广受欢迎，其实Biacore已广泛应用到基础科研与药物开发的多个领域。截至目前，借助Biacore累计发表的文章已突破60000篇，超过100种的已上市药物的研发、申报、生产过程中也均有Biacore的身影。同样期待越来越多新的结合位点被发现并基于这些位点开发出更多优质的药物，助力人类健康事业。

Zhou, Qingtong et al. “Structural insights into the interaction of three Y-shaped ligands with PI3Kα.” PNAS vol. 120,34 (2023): e2304071120.

Favalli, Nicholas et al. “Stereo- and regiodefined DNA-encoded chemical libraries enable efficient tumour-targeting applications.” Nature chemistry vol. 13,6 (2021): 540-548.