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2022中医药十大学术进展发布！Biacore成果榜上有名！

2022中医药十大学术进展发布！Biacore成果榜上有名！

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2023年2月25日，中华中医药学会发布了2022年中医药十大学术进展。张伯礼院士指出：2022年度中医药十大学术进展主要呈现的价值，就包括“重视新技术新方法在中医药中的应用”。北京大学医学部曾克武教授和屠鹏飞教授与浙江大学、大连医科大学、博奥生物研究团队凭借“新技术助力中药功效科学内涵阐释”共同获选2022年度中医药十大学术进展。
中医药研究者中有广泛的Biacore用户基础，曾克武教授和屠鹏飞教授团队的这一成果里自然也有Biacore的身影。接下来就让小编带您领略Biacore这一现代科技，如何与传统中医药碰撞并融合，从而阐释中药功效科学的内涵。

天然产物中抗肿瘤活性分子 发现及作用机制揭示1

肿瘤免疫微环境（Tumor immune microenvironment ，TIME）调控因子IGF2BP1是一种关键N6 -甲基腺苷 (m6A) 阅读蛋白，识别m6A靶点转录物，被认为是肿瘤治疗的潜在靶点。2022年曾克武教授和屠鹏飞教授团队发表的研究成果中，发现了天然产物葫芦素B通过结合IGF2BP1发挥抗肿瘤作用，并且阐释了作用机制。

以IGF2BP1为出发点，作者首先发现，在小鼠H22荷瘤模型中敲低IGF2BP1，可以通过免疫细胞招募和降低TIME中PD-L1的表达来抑制肝细胞癌的进展。使用Biacore 8K，作者验证了IGF2BP1与甲基化单链RNA（ss-m6A）的强亲和力，达到了18.3 nM。并且发现，IGF2BP1与非甲基化RNA（ss-A）的亲和力则低了13倍。

确定了治疗靶点之后，作者使用Biacore 8K，直接从包含889种化合物的中药天然产物库中筛选能抑制IGF2BP1与其m6A靶点的活性分子。通过合成生物素标记的ss-m6A，作者将RNA直接固定在芯片上，将化合物固定浓度（20 μM）与IGF2BP1预孵育，检测RNA与化合物- IGF2BP1的结合信号，从而直接筛选出具有抑制效果的天然产物（图1）。

图1：Biacore 8K抑制剂筛选方法示意图
图1：Biacore 8K抑制剂筛选方法示意图

通过Biacore 8K的高通量抑制剂筛选实验，作者得到了抑制剂筛选的排序。从图2中可以直观看出，六种具有较强抑制效果的天然产物被发现，其中抑制效果最强的当属葫芦素B（CuB）。在Huh增殖抑制实验中，葫芦素B同样表现出了抑制作用，72h时的IC50达到1.0 uM。

图2：Biacore 8K抑制剂筛选结果
图2：Biacore 8K抑制剂筛选结果

高通量筛选+精确表征，在药物研究的各个阶段都少不了Biacore。在筛选得到葫芦素B后，作者当然同样使用Biacore精确表征了IGF2BP1与葫芦素B的亲和力。结果发现，二者的亲和力达到了1.2 μM，与细胞实验相互印证（图3）。

图3：Biacore精确表征IGF2BP1与CuB的亲和力
图3：Biacore精确表征IGF2BP1与CuB的亲和力

葫芦素B又是什么呢？

葫芦素B是从葫芦科等植物中分离得到的一类四环三萜类化合物，具有广泛的药理活性。以葫芦素B为主要成分的葫芦素制剂在临床治疗湿热毒盛所致的迁延性肝炎、肝硬化和原发性肝癌具有确切疗效。中药研究，除了根据已知靶点从天然产物库中找活性分子外，另一个角度则是已知活性分子，寻找作用靶点。在通过抑制剂筛选及表征，从靶点IGF2BP1出发找到活性分子葫芦素B后，作者使用“钩钓”的方法，验证是否能利用葫芦素B“钩”出靶点IGF2BP1。

作者首先合成了葫芦素B分子探针，然后利用pull-down + 质谱的方法从Huh细胞裂解液中成功“钩”到了靶点IGF2BP1，并且在免疫荧光共定位实验中证明了细胞中葫芦素B与IGF2BP1的结合。至此，不论是从靶点出发找活性分子，还是从活性分子出发找靶点，双管齐下，作者明确了葫芦素B与肿瘤免疫微环境调控因子IGF2BP1的直接结合。

为了进一步阐释葫芦素B的抗肿瘤机制，作者研究了IGF2BP1上葫芦素B的结合位置及结合方式。将IGF2BP1的结构域逐一删除后，作者发现只有缺失了C端KH结构域会使IGF2BP1与葫芦素B不能结合。通过质谱、pull-down、BLAST、CD等多种方法，作者最终确定，葫芦素B通过迈克尔加成反应结合在IGF2BP1中KH1−2结构域的Cys253上，并且会引起IGF2BP1的构象变化。

那么葫芦素B又是如何影响IGF2BP1的功能呢？

IGF2BP1本身会与ss-m6A结合，前面作者使用Biacore做了二者抑制剂的高通量筛选，得到了葫芦素B。高通量抑制剂筛选能做，单独的抑制剂表征当然手到擒来。作者设置了Biacore实验来从生化角度上表征葫芦素B的抑制效果。从结果可以看出，随着葫芦素B的浓度逐渐提高，IGF2BP1与ss-m6A的结合信号越来越低（图4）。Biacore结果与RNA pull-down实验一致，明确了葫芦素B可以抑制二者结合。

图4：Biacore实验明确葫芦素B抑制IGF2BP1与ss m6A的结合
图4：Biacore实验明确葫芦素B抑制IGF2BP1与ss m6A的结合

后续作者还发现，葫芦素B可以降低与IGF2BP1所结合的mRNA（包括c-MYC、KRAS 等mRNAs）稳定性，在体内通过诱导细胞凋亡，招募免疫细胞到肿瘤微环境，阻断PD-L1的表达，最终表现出明显的抗肿瘤效果（图5）。

图5：文章主要研究路线及作用机制概述
图5：文章主要研究路线及作用机制概述
图5：文章主要研究路线及作用机制概述

曾克武教授和屠鹏飞教授团队专注于天然活性分子治疗各类型重大疾病的发现及机制阐释，开发了包括分子探针、蛋白芯片2在内的多种靶点“钩钓”技术，多年以来，许多研究成果中均使用了Biacore作为生物分子相互作用检测技术。中国科学院院士陈凯先教授指出：年度的学术进展是中医药学术研究的“指南针”和“风向标”。相信此次研究成果的入选，也将为广大中医药研究者提供更多研究思路，对“积极推进中医药科研和创新，推动传统中医药和现代科学结合”有重要意义。

Biacore

作为现代化的体外分子互作“金标准”，以其超高的灵敏度，超高的数据质量，无分子量检测下限，适用于各类型的天然产物及生物分子研究，在中医药研究者中有广泛的用户基础。Biacore将持续与广大中医药研究者勠力同心，共同推动中医药的现代化研究和应用。

参考文献：

[1] Liu Y , Guo Q , Yang H , et al. Allosteric Regulation of IGF2BP1 as a Novel Strategy for the Activation of Tumor Immune Microenvironment[J]. 2022.

[2] Zhang et al. Neuroinflammation inhibition by small-molecule targeting USP7 noncatalytic domain for neurodegenerative disease therapy, Sci. Adv. 8, eabo0789 (2022)

从草药提取物到突破性疗法：Biacore “点亮”精准医疗

从草药提取物到突破性疗法：Biacore “点亮”精准医疗

从草药提取物到突破性疗法：Biacore “点亮”精准医疗

胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最常见和最具侵袭性的原发性恶性脑肿瘤，发病率高、死亡率高、患者预后差。

恶性胶质瘤治疗中，顺铂已被用作辅助治疗，但其副作用较大，因此，需要开发新的治疗药物和新的药物靶点。

2025年初， 由南开大学陈悦团队发明的候选新药ACT001已被国家药品监督管理局药品审评中心纳入我国突破性治疗品种名单，为脑胶质瘤等恶性肿瘤的治疗带来了新的希望!

ACT001突破性治疗公式详细信息

图1：ACT001突破性治疗公式详细信息

ACT001的诞生是“老药新用”与结构优化的典范。其前体小白菊内酯源自中国特有植物辛夷树根皮（含量高达6%），课题组通过三步化学修饰，显著提升了其生物利用度与靶向性。

这种“源于自然，优于自然”的策略，既保留了天然产物的低毒性优势，又通过现代药物化学技术克服了传统中药成分溶解度差、代谢快等缺陷，为中药现代化提供了新范式。

早在2019年，南开大学陈悦教授课题组就在Cell Death & Disease发表的题为“ACT001, a novel PAI-1 inhibitor， exerts synergistic effects in combination with cisplatin by inhibiting PI3K/AKT pathway in glioma”的研究论文，揭示了ACT001作为一种新型的PAI-1抑制剂，可通过抑制PI3K/AKT信号通路，有效抑制胶质瘤细胞的增殖、侵袭和转移，并诱导细胞凋亡。

且与顺铂联合使用，可以增强抗肿瘤效果，为胶质瘤的治疗提供了新的策略。此次突破性治疗资格的获批，进一步验证了其临床转化潜力，为联合疗法开发提供了理论基石。

ACT001是草药活性物质小白菊内酯的结构优化产物，以小白菊内酯为原料，通过三步化学反应合成而来。而小白菊内酯在中国特有植物辛夷树（也叫做山玉兰）中的含量很高，其根皮中的含量高达6%。

在本研究中，为了确认PAI-1与MCL结合的分子机制，作者选择了Biacore分子互作系统进行分子水平的直接结合实验。

结果表明PAI-1与ACT001、MCL和PAI-039（一种已知的PAI-1抑制剂）的KD值分别为2.31 mM、10.8 μM和4.51 μM（如图2所示）。

Biacore从分子水平证明ACT001与PAI-1的相互作用

图2：Biacore从分子水平证明ACT001与PAI-1的相互作用

此外，ACT001与1× PBS（pH 7.4）37℃孵育过夜后，PAI-1与ACT001的KD值为9.08 μM，与MCL与PAI-1的KD值基本一致（如图3所示)。这是因为，经过一夜的孵育，活性产物MCL被释放并与PAI-1相互作用。
ACT001与1× PBS (pH 7.4) 37℃孵育过夜后，PAI-1与ACT001的亲和力测定

图3：ACT001与1× PBS (pH 7.4) 37℃孵育过夜后，PAI-1与ACT001的亲和力测定

最后，作者还通过体外和体内实验，发现 ACT001 与顺铂联合使用，可以显著增强抗肿瘤效果，抑制肿瘤生长。

作者根据以上研究，得出最终ACT001的抗肿瘤机制：

PAI-1通过PI3K/AKT信号通路促进胶质瘤细胞增殖。ACT001通过直接结合PAI-1发挥其抗胶质瘤作用（如图4所示）。
ACT001抑制肿瘤进展的机制

图4：ACT001抑制肿瘤进展的机制

ACT001的成功研发是产学研深度融合的典范。南开大学陈悦团队依托国家自然科学基金重点项目和天津市生物医药产业创新联盟的支持，与天津国际生物医药联合研究院、华海药业等机构建立了长期战略合作。

在药物早期开发阶段，高校负责活性成分的结构优化与机制研究，而企业则提供规模化合成工艺开发与质量控制技术支持。

从草药提取物到突破性疗法，ACT001的研发历程体现了多学科交叉的创新力量。而Biacore作为分子互作研究的核心工具，始终贯穿于靶点发现、机制验证及药物优化的全周期。

从基础科研到药物获批，从中药小分子到生物大分子，Biacore作为分子互作领域检测的“金标准”始终陪伴着科学家们在基础科研，药物发现，研发与制造的每一个环节，见证着一个个原创新药的诞生。

随着精准医疗时代的到来，Biacore SPR分子互作技术将继续推动更多“first-in-class”药物的诞生，为癌症等重大疾病的治疗开辟新路径。

未来，Biacore SPR分子互作系统会与各位共同见证更多像ACT001的突破性药物问世，推动未见技术，加速非凡疗法，改变人类健康的未来。

Biacore, for a better life!

黄金钓手Biacore｜小功能，大应用

黄金钓手Biacore｜小功能，大应用

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Biacore上市三十余年，因其灵敏度高、功能全面、自动化水平高等特性，助力了超过6.5万篇科学论文的发表，应用领域百花齐放。“百花”中，除了经典的动力学/亲和力测定外，药物筛选、竞争性结合、效价测定、构效关系、组装顺序、未知因子发现等相关科研成果也是“花团锦簇”，这些与Biacore实时、无标记、高灵敏、高通量等特点息息相关。今天我们就一起来关注Biacore的样品回收-“垂钓”功能携手传统中医药等研究共同“绽放”的相关成果。

SPR-MS-SPR：荷叶中TNF-α抑制剂的发现与鉴定

二黄祛脂颗粒由升降散化裁而成，具有降脂抗炎的功效，临床中被用于非酒精性脂肪肝炎的治疗。为了明确二黄祛脂颗粒中抗炎的活性分子，石河子大学新疆植物药资源利用教育部重点实验室的研究团队选择肿瘤坏死因子α (TNF-α) 为靶点，利用Biacore制备TNF-α芯片，“垂钓”中草药提取物中的活性分子，并用LC-MS进行鉴定得到3种活性分子。随后作者继续用Biacore测定了三种活性分子与靶点TNF-α的亲和力，明确其结合能力，最终在细胞水平证明其TNF-α抑制剂的作用。相关成果于2023年发表在Analytical and Bioanalytical Chemistry[1]。

图1：荷叶中TNF-α抑制剂的发现与鉴定研究思路
图1：荷叶中TNF-α抑制剂的发现与鉴定研究思路

双靶点药物发现策略

中药作用机制广泛存在多组分、多靶点的作用特征，基于此，第二军医大学的研究团队，利用Biacore开发了一种双靶点药物开发方法，相关成果近期发表在Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis[2]。文章选取S蛋白RBD和ACE2，将其分别偶联在芯片的不同通道上，用两种配体蛋白，同时“垂钓”中草药提取物中的活性分子，与其中一种或同时与两种配体有结合的分子，并进行质谱鉴定。随后作者再次用Biacore检测了两个靶点与鉴定得到的活性分子的亲和力，最终发现葛根中的葛根素对S蛋白RBD和ACE2均具有特异性结合亲和力。

图2：双靶点“配体垂钓”药物发现流程

图2：双靶点“配体垂钓”药物发现流程

除了双靶点“配体垂钓”，6通道的Biacore设备将赋予多靶点药物发现更多可能！

膜蛋白靶点药物发现

膜蛋白在很多生理过程中发挥重要作用，约一半的小分子药物以膜蛋白为靶点。在膜蛋白靶点的药物发现中，膜蛋白制备困难，体外纯化的膜蛋白颗粒与化合物分子量差异巨大，因此实验方案受限。为了应对这些难题，第二军医大学的研究团队首先制备了膜蛋白-慢病毒颗粒CXCR4-LVPs，选择Biacore，将LVPs偶联在CM5芯片上，通过阳参药物AMD3100验证了方法的可靠性。作者随后继续使用Biacore对中草药提取物进行膜蛋白“配体垂钓”，从川芎提取液中获得了Senkyunolide I，并且用Biacore测定其与CXCR4的亲和常数为2.94±0.36 μM。综上，作者成功构建了一种基于Biacore的膜蛋白靶向活性成分发现策略，此方法将成为从作用于膜蛋白的复杂系统中筛选目标成分的有效工具[3]。

图3：Biacore-膜蛋白“配体垂钓”方法路线
图3：Biacore-膜蛋白“配体垂钓”方法路线

α-酮戊二酸降糖新靶点发现

除了通过配体“垂钓”活性分子，用药物反向“垂钓”靶点当然也可以通过Biacore完成。为了研究α-酮戊二酸 (AKG) 降糖的新机制，华南农业大学的研究团队首先将AKG修饰生物素，利用Biacore将其偶联在SA芯片上，然后用AKG“垂钓”肝脏提取总蛋白样品中可能结合的靶蛋白，最终鉴定得到P2RX4[4]。

图4：利用Biacore SA-AKG芯片“垂钓”靶蛋白
图4：利用Biacore SA-AKG芯片“垂钓”靶蛋白

肿瘤迁移、侵袭机制发现

Mas受体通过Ang- (1-7) 依赖的AKT信号传导促进透明细胞肾细胞癌 (ccRCC) 细胞的迁移和侵袭，而其机制并不明确。首都医科大学的研究团队，利用Biacore将Mas-CT蛋白偶联在芯片上，从细胞裂解液中“垂钓”与其结合的蛋白，并利用质谱鉴定得到8种含PDZ结构域的蛋白。后续发现NHERF4是多个独立ccRCC数据集中唯一下调的基因，确定了NHERF4是ccRCC侵袭性的一种新的调节因子[5]。

图5：利用Biacore从细胞裂解液中“垂钓”与Mas-CT结合的蛋白

图5：利用Biacore从细胞裂解液中“垂钓”与Mas-CT结合的蛋白

果实成熟机制

果实成熟是一个受转录因子、激素和其他调节因子共同作用的复杂过程，在调控果实成熟的转录因子网络中，MADS-box转录因子是一个重要的调节因子。SlFERL作为MADS-box转录因子可能的靶基因，在果实成熟过程中具有潜在的作用。通过蛋白Biacore的“垂钓”实验，研究人员在果实提取物中找到了与SlFERL结合的S-腺苷蛋氨酸合成酶1 (SISAMS1) [6]。

 

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又双叒叕“钓”到大鱼了，Biacore助力发现番茄果实成熟的秘密

“垂钓”，即利用Biacore将粗样品中与芯片表面配体有结合的分子洗脱回收，然后用质谱等方法鉴定回收的样品，继而用Biacore检测二者精准的动力学/亲和力测定，串起了SPR-MS-SPR的研究路线。据小编不完全统计，目前使用此功能发表的文章近百篇，其中中国学者发表数量接近一半！研究领域涵盖了中医药研究、药物开发、分子机制、蛋白组学、植物学、诊断方法开发等等。相信此功能未来将会支撑更多的成果发表，Biacore也将不遗余力支持中国学者的科研创新和进步！

参考文献：

[1]. Guan JW, Xu Y, Yu W, et al. Biosensor-based active ingredient recognition system for screening TNF-α inhibitors from lotus leaves. Anal Bioanal Chem. 2023;415(9):1641-1655. doi:10.1007/s00216-023-04565-2

[2]. Zhang Y, Wang D, Wang X, et al. A dual-target SPR screening system for simultaneous ligand discovery of SARS-CoV-2 spike protein and its receptor ACE2 from Chinese herbs. J Pharm Biomed Anal. 2024;245:116142. doi:10.1016/j.jpba.2024.116142

Biacore解锁中药奥秘：精准药理与高效筛选

Biacore解锁中药奥秘：精准药理与高效筛选

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中医药学，作为中华民族悠久历史文化的瑰宝，历经数千年的实践与发展，已经形成了独特的理论体系与治疗方法。其“整体观念”与“辨证论治”的核心思想，在维护人类健康、治疗疾病方面展现出了不可替代的价值。然而，随着现代科学技术的发展，传统中医药学面临着如何与现代科学相结合，实现其现代化、国际化的挑战。

在这一背景下，深入研究中医药的药理机制，明确其活性成分及其与生物靶标之间的相互作用，从而进行新药开发，成为中医药现代化研究的关键所在。这不仅有助于提升中医药的临床疗效，还能为中药新药的开发提供科学依据，促进中医药在全球范围内的广泛应用。

Biacore基于表面等离子共振 (SPR) 技术，凭借其高灵敏度、实时检测以及无需标记等优势，为中医药研究提供了一种全新的视角和工具。不仅是对传统研究方法的有益补充，更可以推动中医药现代化、国际化。

中药活性成分解析

2021年，第二军医大学联合上海大学建立了一套基于Biacore的方法来筛选中药活性成分的方法。以白芍根 (RPA) 为例，利用Biacore技术揭示了白芍根抗炎机制及其活性成分。

研究人员利用Biacore CM5芯片固定TNF-R1蛋白，将一系列不同稀释比的RPA提取物注入芯片表面，以初步评估潜在生物活性成分与TNF-R1之间的相互作用。有趣的是，RPA提取物对TNF-R1的结合活性呈浓度依赖性（图1.A），这表明RPA提取物中的某些成分能够与TNF-R1结合。为了揭示哪些成分能够与TNF-R1结合，研究人员使用Biacore进行了垂钓实验，回收到了与TNF-R1结合的活性成分。将收集到的样品在UPLC-QTOF/MS系统上进行鉴定（图1.B-F）， 实验结果显示，芍药苷和丹皮酚被鉴定为潜在的活性成分。

图1：通过SPR及质谱技术发现白芍根中的活性成分

图1：通过SPR及质谱技术发现白芍根中的活性成分

为了进一步确认芍药苷和丹皮酚直接与TNF-R1相互作用，研究人员通过Biacore测定出芍药苷与TNF-R1的亲和力为4.9μM（图2.A和B），丹皮酚与TNF-R1的亲和力为11.8 μM（图2.C和D）。

图2：Biacore技术测定芍药苷、丹皮酚与TNF-R1的亲和力
图2：Biacore技术测定芍药苷、丹皮酚与TNF-R1的亲和力

为了探究芍药苷和丹皮酚如何发挥其药理学活性，研究人员设计了Biacore竞争实验。首先，验证了芍药苷和丹皮酚与TNF-α不结合（图3.A和B）。然后，将芍药苷（10或20 mM）与TNF-α预混合并进行Biacore检测。与单独TNF-α相比，混合物中芍药苷浓度越高，响应越低（图3.C）。这一结果表明，芍药苷在与TNF-R1结合时能够与TNF-α竞争。同样，也观察到了丹皮酚与TNF-α之间类似的竞争关系（图3.D）。竞争分析表明，来自白芍根的这两种化合物和TNF-α可能具有TNF-R1的相同结合位点，并能够相互竞争；因此，芍药苷和丹皮酚通过阻断TNF-α与TNF-R1的结合，从而发挥其抗炎作用。

图3：Biacore竞争实验验证芍药苷和丹皮酚将阻断TNF-α对TNF-R1的生物作用
图3：Biacore竞争实验验证芍药苷和丹皮酚将阻断TNF-α对TNF-R1的生物作用

在本研究中，研究人员开发了一种综合策略，将基于Biacore的筛选、亲和力测定和阻断/竞争实验相结合，探索中药生物活性成分，这种策略不仅可以用于阐明中药的作用机制，还可以用于发现新型中药衍生药物。

天然产物开发

慢性高血压是人类最常见的慢性疾病之一，其长期发展可通过引起心脏、肾脏、大脑和眼睛等多个靶器官的结构和功能变化，严重危害人类健康。目前，血管紧张素转化酶抑制剂 (ACEI) 已成为预防和控制高血压最常用的治疗方法之一。卡托普利、依那普利、福辛普利等ACEI药物在临床实践中得到了广泛应用。然而，尽管这些药物具有治疗效果，但也伴随着一些严重的副作用。近年来，许多天然化合物被发现具有强大的ACEI活性。

近年来，已经创建了多种筛选天然抑制剂的技术，包括磁珠固定化、酶固定化、比色法、分光光度法、荧光法、高效液相色谱法等。但这些方法存在实验复杂，结果易受温度影响，结果重复性差的问题，此外，上述方法无法提供抑制剂与靶标的动力学信息，这对于后续的构效关系研究和化合物的结构转化至关重要。

研究人员选择了Biacore技术作为筛选天然化合物的关键技术，如表1所示，槲皮素、原花青素、异槲皮苷、金丝桃苷、芹菜素、葛根素和槲皮素醇等化合物均以剂量依赖的方式与芯片上的可溶性ACE1 (sACE1) 结合，类似于阳性试剂卡托普利。对比发现，异槲皮苷（图4）对sACE1的亲和力最强（KD 5.76×10−6 M），而阳性对照卡托普利和槲皮素醇的亲和力最弱（KD 4.83×10−5 M）。

表1：Biacore检测天然化合物、阳性对照与sACE1的亲和力
表1：Biacore检测天然化合物、阳性对照与sACE1的亲和力

图4：Biacore检测异槲皮苷与sACE1的亲和力
图4：Biacore检测异槲皮苷与sACE1的亲和力

此外，在该研究中，研究人员通过分子对接模拟，筛选出了与ACE1的C端和N端结构域对接的白藜芦醇。然而，Biacore测定显示它与ACE1没有直接的结合，酶活性测试的结果与Biacore的结果一致，白藜芦醇在体外并不抑制ACE1。因此，“分子对接+Biacore”干湿实验相结合的方法才能最大保障结果的准确性。

总 结

综上所述，Biacore技术在中药研究中具有以下优势，可以为中药的深入研究、新药发现提供了强有力的技术支撑。

  • 精准评估：Biacore能够实时、无标记地监测生物分子间的相互作用，从而精准评估中药成分与生物靶点的亲和力以及动力学参数。
  • 高灵敏度：Biacore技术具有极高的检测灵敏度，能够检测到极低浓度的中药成分与生物靶点的相互作用。
  • 无分子检测下限：Biacore检测无分子量下限，不仅可以检测高分子量的多糖、蛋白质，还可以应用于低分子量的生物碱、黄酮类、萜类等小分子化合物的检测。
  • 高效筛选：Biacore技术能够快速地筛选中药中的复杂成分，尤其是那些与特定生物靶点（如酶、受体等）有潜在相互作用的活性成分。

通过引入Biacore等现代生物技术手段，中药研究得以从传统的经验式、试错式研究向科学化、精准化转变，推动了中药的现代化进程，提升了中药在国际医药市场上的竞争力。

参考文献

[1]. Lv D, Xu J, Qi M, Wang D, Xu W, Qiu L, Li Y, Cao Y. A strategy of screening and binding analysis of bioactive components from traditional Chinese medicine based on surface plasmon resonance biosensor. J Pharm Anal. 2022 Jun;12(3):500-508. doi: 10.1016/j.jpha.2021.11.006. Epub 2021 Dec 1. PMID: 35811628; PMCID: PMC9257445.

[2]. Wu Q, Jiao Y, Luo M, Wang J, Li J, Ma Y, Liu C. Detection of Various Traditional Chinese Medicinal Metabolites as Angiotensin-
揭开中药的神秘面纱（三）：探索黄连素的奇幻世界

揭开中药的神秘面纱（三）：探索黄连素的奇幻世界

揭开中药的神秘面纱（三）：探索黄连素的奇幻世界

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俗话说“哑巴吃黄连，有苦说不出”，中药文化博大精深，在一众苦味中药中，黄连可谓是拥有举足轻重的江湖地位。我们今天的主角黄连素（Berberine，BBR）就是从黄连中分离提取得到的一种异喹啉类生物碱，具有抗菌、降血糖血脂、抗痢疾等多种药理活性。

随着现代科研水平的不断提高，黄连素还在持续展现着更多的生物学活性，例如抑制凝血酶的活性，免疫检查点的抑制剂，抗癌症的作用等等。黄连素作为一种分子量只有336的小分子天然产物，科研工作者都不约而同地选择高灵敏度的Biacore检测技术在分子水平上进行研究。接下来大家就跟随小编一起走进黄连素的奇幻世界吧。

01. 高效的凝血酶抑制剂

凝血酶（Thrombin）是血液凝固级联反应中的关键酶，被认为是多种心血管疾病中重要的药物靶点。首都医科大学和北京中医药大学的科研团队在传统中药中筛选特异性抑制凝血酶的小分子抑制剂，最终得到的黄连素（Berberine，BBR）被证明可以直接结合凝血酶从而抑制其诱导的血小板聚集。

研究人员首先在Biacore上证明了Berberine可以直接与凝血酶结合，两者的亲和力为16.39 μM（图1A/B），比已上市的抗凝血药阿加曲班（Argatroban）的亲和力更高（图1C/D，KD=53.78 μM）。

图1， Biacore检测Berberine/ Argatroban与Thrombin的结合
图1， Biacore检测Berberine/ Argatroban与Thrombin的结合

接下来，研究人员利用Biacore特有的ABA进样设计竞争实验，证明Berberine与Argatroban结合在Thrombin相同的位点上。ABA 的进样方式简化了竞争实验的设置，允许两种不同的溶液按照溶液 A/溶液 B/溶液 A 的顺序在同一个循环内进样，由于竞争样品无需再溶解在运行缓冲液里，大大减少了竞争样品的消耗量，非常适用于药物的竞争分析（图2）。

图2，ABA进样设置Berberine和Argatroban的竞争实验
图2，ABA进样设置Berberine和Argatroban的竞争实验

从图3 的实验结果中可以看到，Berberine不存在时Argatroban与Thrombin有明显的结合信号（图3，red line）；而在300 μM Berberine存在的情况下（ABA样品设置参照图2），Argatroban与Thrombin的结合响应值明显降低（图3，blue line）。证明Berberine在Thrombin上的结合位点与Argatroban是一样的。综合后续的血小板凝集实验，这一研究说明Berberine是潜在的安全有效的凝血酶抑制药物。

图3，Berberine和Argatroban竞争实验结果
图3，Berberine和Argatroban竞争实验结果

02. 全新的免疫检查点抑制剂

PD-1/PD-L1是肿瘤免疫疗法研究的热点，目前已有多款PD-1/PD-L1单抗药物上市。2020年，中国医学科学院北京协和医院的研究人员发现黄连素（Berberine，BBR）也是一种潜在的免疫点抑制剂，能够通过减少癌细胞表面PD-L1的表达，增强免疫T细胞对癌细胞的杀伤作用。

研究发现，Berberine通过结合泛素化调节靶点CSN5，抑制其去泛素化活性，促进PD-L1的泛素化降解（图4A）。如何直接证明Berberine与靶点CSN5的结合呢？研究人员在Biacore上将CSN5直接偶联到CM5芯片上，Berberine作为分析物进样，得到两者之间的亲和力KD=16.25 μM，有力证明了Berberine与靶点的结合（图4B）。该研究揭示了一种全新的Berberine抗肿瘤机制，表明Berberine是一种潜在的免疫检查点抑制剂。

图4，Biacore检测Berberine与CSN5靶点的结合
图4，Biacore检测Berberine与CSN5靶点的结合

03. 胰腺癌转移及肿瘤代谢抑制剂

胰腺癌在肿瘤领域素有“癌症之王”的称号，科研工作者从未停止对胰腺癌相关机制及治疗药物的研究。近年来多个研究工作中发现黄连素在胰腺癌的转移和肿瘤代谢方面有明显的抑制作用。

2022年北京大学第三医院等单位研究发现黄连素（Berberine，BBR）能够有效抑制胰腺癌的肺部转移。Biacore直接验证了Berberine与转化生长因子β受体1（TGFBR1）的结合（图5B），两者的亲和力KD=18 μM。Berberine通过抑制TGFBR1的活性，保护内皮屏障免受破坏从而阻止癌细胞的跨内皮迁移（图5A）。文章认为Berberine在临床中是一个有潜力的抑制胰腺癌肺部转移的药物。

图5，Biacore检测Berberine与TGFBR1靶点的结合
图5，Biacore检测Berberine与TGFBR1靶点的结合

同样是在胰腺癌的研究中，2021年复旦大学的研究人员报道了黄连素（Berberine，BBR）通过抑制乳酸脱氢酶A（LDHA）延缓肿瘤发展的作用。研究认为，LDHA的催化产物乳酸可以调节肿瘤微环境，促进肿瘤细胞转移、浸润、侵袭和恶化；同时还能通过AMPK/mTOR这一信号通路促进肿瘤的发展（图6A）。因此LDHA是胰腺癌治疗中的一个重要靶点。Biacore结果表明，Berberine可以特异性结合LDHA（图6B，KD=4.59 μM）并抑制其活性，阻止胰腺癌细胞增殖和侵染。

图6，Biacore检测Berberine与LDHA的结合
图6，Biacore检测Berberine与LDHA的结合

04. 抑制耐药性细菌形成生物被膜

黄连素（Berberine）广泛用于治疗微生物感染，北京大学的研究团队解析了黄连素抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）的内在机制。金黄色葡萄球菌的耐药性往往与其形成生物被膜密切相关，在MRSA的被膜基质中均发现有淀粉样纤维（amyloid fibril）的存在，而这种淀粉样纤维主要是由称作酚可溶性调节肽（Phenol-Soluble Modulins，PSMs）的小肽组成的。

研究发现Berberine特异性结合PSMα2单体中Phe19的苯环（图7A），抑制PSM聚集形成淀粉样纤维，从而抑制MRSA形成生物被膜，加强抗生素对MRSA的抑制效率。在分子水平上通过Biacore验证了两者的结合，实验中将合成的PSMα2多肽（fMGIIAGIIKFIKGLIEKFTGK）固定在芯片上，Berberine作为分析物进样，成功地检测到多肽和小分子的相互作用（图7B）。

图7，Biacore检测Berberine与PSMα2多肽的结合
图7，Biacore检测Berberine与PSMα2多肽的结合

05. 总结

我们近期推出的《揭开中药的神秘面纱》系列主题（揭开中药名方的神秘面纱，原来得靠它；揭开中药的神秘面纱（二）：Biacore解析中药治疗新冠机制）所展现的只是中医药浑厚延绵的画卷中一个小小的缩影，但从中就已经深深体会到Biacore在中医药天然产物研究中的重要作用。作为分子互作领域的“金标准”，Biacore在中医药天然产物的研究中体现了无与伦比的高灵敏度、坚实的数据质量和广泛的应用场景，助力中医药这一中华文明的瑰宝发挥更加重要的作用，推动健康事业的进步。

参考文献：

1.Wang, X. et al. Identifcation of berberine as a direct thrombin inhibitor from traditional Chinese medicine through structural, functional and binding studies. Sci. Rep. 7, 44040; doi: 10.1038/srep44040 (2017)

2.Liu, Yang, et al. “Berberine diminishes cancer cell PD-L1 expression and facilitates antitumor immunity via inhibiting the deubiquitination activity of CSN5.” Acta Pharmaceutica Sinica B 10.12 (2020): 2299-2312.

3.Tian W, Hao H, Chu M, Gong J, Li W, Fang Y, Zhang J, Zhang C, Huang Y, Pei F and Duan L (2022) Berberine Suppresses Lung Metastasis of Cancer via Inhibiting Endothelial Transforming Growth Factor Beta Receptor 1. Front. Pharmacol. 13:917827. doi: 10.3389/fphar.2022.917827

4.Cheng C.-s, Tan H-Y, Wang N, et al. Functional inhibition of lactate dehydrogenase suppresses pancreatic adenocarcinoma progression. Clin Transl Med. 2021;11:e467. https://doi.org/10.1002/ctm2.467

5.Chu M, Zhang MB, Liu YC, Kang JR, Chu ZY, Yin KL, Ding LY, Ding R, Xiao RX, Yin YN, Liu XY, Wang YD. Role of Berberine in the Treatment of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infections. Sci Rep. 2016 Apr 22;6:24748. doi: 10.1038/srep24748.PMID:2710306

2;PMCID: PMC4840435.

揭开中药的神秘面纱（二）：Biacore解析中药治疗新冠机制

揭开中药的神秘面纱（二）：Biacore解析中药治疗新冠机制

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SARS-CoV-2自2019年底首次报告以来，科学家在与新冠病毒争分夺秒赛跑的同时已经研制出了多种新冠疫苗并取得了显著的成果。然而新冠病毒突变体具有更高的传染性，并包含导致部分免疫逃逸的突变，因此针对病毒特效药的研发仍旧是目前新冠研究工作的热点领域。

中药作为我国的传统医药，有着五千多年历史，是伟大祖先在长期实践中积累起来的宝贵经验和财富，自然在对抗新冠病毒的道路上也会是不可或缺的一份子。然而中药大多是天然植物，其中的成分少则几十种，多则几百种，如何攻克这一在中药研究过程中的关键问题呢？就让小编带领大家一起走进中药研究前沿，看看科学家们都选择了怎样的实验手段来攻克这一难题。

Schaftoside—治疗新冠候选药物的发现

2022年，北京大学和武汉病毒所在Acta Pharm Sin B杂志上联合发表了题为《Schaftoside inhibits 3CLpro and PLpro of SARS-CoV-2 virus and regulates immune response and inflammation of host cells for the treatment of COVID-19》的文章。找到了一种很有前途的预防和治疗新冠肺炎的候选药物—Schaftoside。

前期已有研究表明3-凝乳蛋白酶样蛋白酶(3CLpro)和木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLpro)是治疗SARS-CoV-2的抑制剂的结合关键靶点。并且Molnupiravir和Paxlovid已被批准成为第一批治疗SARS-CoV-2的小分子口服药，但由于其价格昂贵，而且要在症状出现后的5天内服用，否则无效。因此本文作者就从此出发想要找到更加有效、平价的抗新冠病毒药物，最终在12种中草药的125个甘草化合物中筛选到了Schaftoside这一有效的天然产物并表现出良好的安全性和药代动力学特性。

为了阐明Schaftoside与3CLpro和PLpro的结合机制，作者首先就利用Biacore-SPR技术对Schaftoside与3CLpro和PLpro的结合特异性进行检测，将3CLpro和PLpro利用氨基偶联的方式固定在CM5芯片上，Schaftoside以流动相的形式流过芯片表面进行检测。结果显示Schaftoside与3CLpro和PLpro结合，KD值分别为12.4和13.2 μmol/L。

接下来，为了验证结晶实验获得的多个关键氨基酸位点，作者对这些位点进行了定点突变，并同样利用了Biacore检测了Schaftoside与多种突变体的结合亲和力，随后也对其进行了酶活的测定。对于3CLpro H41A突变体，Schaftoside的抑制率为50.9%，显著低于野生型（67.5%）；突变体G143A和R188A的抑制率分别大幅下降至32%和40.3%。与此同时，作者也对PLpro 的K157A、E167A和Y268A进行了定点突变，检测了其与Schaftoside的亲和力和酶活。结果表明Schaftoside可以与所有三种突变体结合，尽管Y268A的作用比野生型弱4倍左右；Schaftoside对Y268A具有较低的抑制活性，抑制率为33.7%。Schaftoside与K157A和E167A的抑制活性分别降低至52.3%和53.3%（如图1）。并且酶活检测数据SPR检测结果是保持一致的。综上所述，Y268、K157和E167是与Schaftoside结合的关键氨基酸残基。

图1. Biacore测定Schaftoside与3CLpro、PLpro及其突变体的亲和力图谱
图1. Biacore测定Schaftoside与3CLpro、PLpro及其突变体的亲和力图谱

本篇文章中，作者不仅利用Biacore鉴定了中草药中的活性成分Schaftoside与3CLpro和PLpro的结合机制，还通过Biacore进一步确定了相互作用的关键氨基酸位点，阐明了Schaftoside与3CLpro和PLpro的结合机制。

中药虎杖的活性成分—白藜芦醇苷及白藜芦醇对新型冠状病毒复制的有效抑制作用

同样是开发针对3CLpro和PLpro靶点治疗新冠病毒的抑制剂，河北医科大学药学院等单位在Frontiers in Bioscience-Landmark杂志上发表了题为《Effective inhibition of coronavirus replication by Polygonum cuspidatum》的文章。在中药虎杖中找到了有效成分—白藜芦醇苷及白藜芦醇，可以作为一种潜在的治疗新型冠状病毒感染的广谱抑制剂。

已有研究表明轻症和普通症的患者早期使用中药可迅速改善症状，缩短住院时间，减少轻症和普通症的重症转化。在抗SARS-CoV-2的研究中，虎杖就被推荐为新冠肺炎的治疗药物。本篇文章作者就在此基础上确定了虎杖中治疗冠状病毒感染的有效成分—白藜芦醇苷及白藜芦醇。

作者首先在细胞水平验证白藜芦醇苷及白藜芦醇对新型冠状病毒的抑制作用分别为420.6 µmol/L 和 182.4 µmol/L，接着就利用了Biacore在分子层面验证了它们之间的结合亲和力。作者将SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV的3CLpro和PLpro蛋白以氨基偶联的方式固定在CM5的芯片表面，白藜芦醇苷及白藜芦醇作为流动相流过芯片表面，检测其结合亲和力和动力学。

结果显示：SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV的3CLpro和PLpro与白藜芦醇苷结合表现出强烈的剂量依赖性反应，KD分别为16.01 μM、5.428 μM、16.44 μM、39.53 μM、1.976 μM、7.745 μM（如图2所示）；SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV的3CLpro和PLpro同样也与白藜芦醇表现出了强烈的剂量依赖性反应，KD分别为0.9812 μM、92.51 μM、7.312 μM、12.35 μM、1.556 μM和6.1 μM（如图3所示）。综上所述，白藜芦醇苷和白藜芦醇对SARS-CoV-2、SARS-CoV 3CLpro和PLpro蛋白有特异性亲和力，可通过与3CLpro活性中心和PLpro蛋白结合抑制病毒复制。

图2. Biacore检测白藜芦醇苷与SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV的3CLpro和PLpro亲和力图谱
图2. Biacore检测白藜芦醇苷与SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV的3CLpro和PLpro亲和力图谱

图3. Biacore检测白藜芦醇与SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV的3CLpro和PLpro亲和力图谱
图3. Biacore检测白藜芦醇与SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV的3CLpro和PLpro亲和力图谱

连花清瘟胶囊防治新冠肺炎药理活性成分和机制解读

中药连花清瘟（LHQW）胶囊已被临床证明对治疗新型冠状病毒感染的新型冠状病毒肺炎是有效的，其通过显著抑制新型冠状病毒在细胞中的复制，抑制宿主细胞炎症因子的表达，从而发挥抗新冠病毒活性的作用。2021年，海军医科大学药学院联合福建省创新药物靶点研究重点实验室等单位在Acta Pharmaceutica Sinica B杂志上发表了题为《Identifying potential anti-COVID-19 pharmacological components of traditional Chinese medicine Lianhuaqingwen capsule based on human exposure and ACE2 biochromatography screening》的文章，揭示了LHQW中的活性成分及其抗COVID-19的药理机制。

 

 

 本篇文章研究思路如下（如图4所示），作者首先采用高分辨质谱仪（HRMS）和数据库挖掘相结合的方法，对反复给药后的人血浆和尿液中LHQW的成分谱进行分析，检测出了132种LHQW的原型成分和代谢产物成分。随后综合ACE2生物色谱法筛选得到的数据，共鉴定出了8种直接与人接触且具有潜在ACE2靶向能力的活性成分，并利用Biacore验证了这8个候选活性成分与ACE2重组蛋白的亲和力。

图4. 连花清瘟抗新冠肺炎潜在活性成分研究的主要过程和结果

图4. 连花清瘟抗新冠肺炎潜在活性成分研究的主要过程和结果

其中最为关键的一步验证药物与靶标的结合特异性并检测其亲和力，作者就是借助Biacore完成的，且本篇文章所有Biacore实验可由一块CM5芯片完成。其检测结果表明，在血清中含量较高的扁桃苷和野黑樱苷具有较强的结合亲和力，KD值分别为0.221和0.268 µmol/L。另一种在人血清中高暴露的成分大黄酸与ACE2则具有中等亲和力，KD值为33.3 µmol/L，作者还分析了与大黄酸结构相似的大黄素、芦荟大黄素和大黄素8-o-β-D-葡萄糖苷，Biacore实验表明这些化合物都与ACE2具有结合潜力。此外，连翘苷A和连翘苷I是连翘子的主要成分，对ACE2的亲和力分别为15.8和18.7µmol/L（如图5所示）。

图5. SPR检测8个候选活性成分（A：MLN-4760；B：新绿原酸；C：扁桃苷；D：野黑樱苷；E：连翘苷I；F：芦丁；G：连翘苷A；H：甘草酸；I：大黄酸）与ACE2的亲和力
图5. SPR检测8个候选活性成分（A：MLN-4760；B：新绿原酸；C：扁桃苷；D：野黑樱苷；E：连翘苷I；F：芦丁；G：连翘苷A；H：甘草酸；I：大黄酸）与ACE2的亲和力

SPR是唯一被收录进中、美、日三国药典并被推荐使用的非标记分子互作技术，是检测药物靶标相互作用的金标准。本篇文章正是利用Biacore-SPR技术首次揭示了基于LHQW胶囊原型成分及代谢产物的有效组分治疗COVID-19患者的分子机制，同时也证实了该方法在鉴别中草药的药物活性成分方面的实用性。

 

 

 

综上所述，现今中医药界的焦点问题是阐明中草药中的有效成分，这是探索中药的核心问题，既是保证中药质量安全的基础，也是未来中药的发展方向。而在攻克这一核心问题的过程中大家都不约而同的选择了Biacore—SPR技术作为攻克这一问题的关键利器。

其实至今为止，Biacore不仅在中草药活性成分鉴定方面大放异彩，也在中草药靶点发现，中药理作用机制解析等基础科研领域同样表现出色，帮助我们的研究人员完成了一个又一个的重大突破，所以Biacore早已成为了我们基础科研和药物研发的利器，成为了工业和科研互作领域中的检测金标准，推动了人类健康事业的发展。

参考文献：

1. Chen X, Wu Y, Chen C, Gu Y, Zhu C, Wang S, Chen J, Zhang L, Lv L, Zhang G, Yuan Y, Chai Y, Zhu M, Wu C. Identifying potential anti-COVID-19 pharmacological components of traditional Chinese medicine Lianhuaqingwen capsule based on human exposure and ACE2 biochromatography screening. Acta Pharm Sin B. 2021 Jan;11(1):222-236. 

2. Yi Y, Zhang M, Xue H, Yu R, Bao YO, Kuang Y, Chai Y, Ma W, Wang J, Shi X, Li W, Hong W, Li J, Muturi E, Wei H, Wlodarz J, Roszak S, Qiao X, Yang H, Ye M. Schaftoside inhibits 3CLpro and PLpro of SARS-CoV-2 virus and regulates immune response and inflammation of host cells for the treatment of COVID-19. Acta Pharm Sin B. 2022 Aug 9.

3. Xu H, Li J, Song S, Xiao Z, Chen X, Huang B, Sun M, Su G, Zhou D, Wang G, Hao R, Wang N. Effective inhibition of coronavirus replication by Polygonum cuspidatum. Front Biosci (Landmark Ed). 2021 Oct 30;26(10):789-798.