“Inject and elute”是一个强大的功能模块，它可以用来从传感器芯片的配体上洗脱结合的分析物，并将其收集到目标样品管中。通过重复的“上样-洗脱-回收循环”，可以将目标组分从复杂的样品溶液中“钓出”，并显著提高其浓度，从而方便进行后续的成分鉴定及分析。

结果表明接头蛋白Nck与TCR的CD3ε亚基结合，对TCR信号传导至关重要，但AX-024并未与Nck1-SH3.1直接结合，其作用机制可能并非通过抑制Nck/TCR相互作用来实现，AX-024的确切靶点仍需进一步研究。

我们一般可以使用三种不同的方法将生物分子附着到传感器芯片表面：

结合过程涉及囊泡扩散到表面，以及Sensor Chip L1上的亲脂性结构掺入脂质膜中，非共价锚定囊泡。我们可以通过Sensor Chip L1上的疏水相互作用非特异性地捕获脂质体、纳米盘（nanodiscs）和其他脂蛋白颗粒。该表面为脂质膜的附着提供了位点，同时保持了CM类型传感器芯片的亲水表面特性和共价固定潜力。

以低流速（2至10 μL/min）注入脂质体制备物。通常在几分钟内即可实现足够的脂质体吸附。吸附表现为响应的增加，当表面覆盖接近完成时趋于平缓。在脂质体制备物流过后，让缓冲液流过表面5至10分钟以稳定脂质体层的形成；

对于用纯脂质体制备的表面，可以使用短时间注射10至100 mM NaOH来去除松散结合的结构并稳定基线。注意：此处理可能会损坏含有添加剂（如胆固醇、神经酰胺或蛋白质）的脂质体；

在分析开始时进行几次缓冲液或再生溶液的空白注射以稳定表面。

根据脂质体组成、缓冲条件和温度，脂质体可能会在葡聚糖基质上融合，形成部分或完全覆盖传感器表面的支撑脂质双层。通常，未融合脂质体的表面吸附容量超过10,000 RU，而融合的脂质双层在某些情况下产生的响应在5,000 RU左右。

融合并释放多余脂质的过程，可能在脂质体吸附后表现为响应值的向下漂移。在注入样品之前可能需要等待响应稳定。

为了实现OSR，首先将去污剂溶解的配体固定化或捕获在Sensor Chip L1的两亲性表面上，然后立即暴露于混合的去污剂-脂质胶束注射。胶束自发吸附到传感器表面上的亲脂性残基和配体上的疏水域上。随后去污剂从表面洗脱到缓冲液流中，留下富含配体的重构脂质双层（图1）。

混合胶束在运行缓冲液中制备，通常通过将干燥的脂质制备物溶解在缓冲液-去污剂混合物中。胶束中去污剂和脂质的比例对OSR的成功很重要，并由去污剂的CMC和脂质在给定缓冲液和温度条件下的溶解度决定。最佳比例差异很大，通常必须根据经验进行微调。

对于由辛基葡萄糖苷和POPC组成的胶束，在HBS缓冲液中发现的最佳混合物是7.5 mM辛基葡萄糖苷和3.75 mM POPC。重要的是混合胶束制备物不浑浊（浑浊表明存在囊泡），因为这将导致囊泡捕获而不是膜重构。过量的脂质通常会导致囊泡形成并产生浑浊，而过量的去污剂会损害混合胶束在表面的吸附。

制备混合胶束的推荐程序如下。为了优化脂质-去污剂比例，在建议的浓度范围内准备脂质和去污剂各五种浓度，总共25种脂质-去污剂比例。请注意，脂质和去污剂浓度都需要优化。

在处理去污剂溶解的蛋白质时，在运行缓冲液中添加去污剂可能有助于防止蛋白质功能丧失。为避免传感图假象，通常在运行缓冲液中添加的浓度低于用于溶膜的缓冲液。

另一方面，在类膜环境中的分析需要无去污剂运行缓冲液，因为去污剂可能干扰脂质结构。类膜环境包括例如蛋白脂质体、重构膜、nanodiscs、Salipro技术、病毒样脂蛋白颗粒（VLPs）和苯乙烯马来酸脂质颗粒（SMALPs）。

图1：抗原表位分析的实验方法示意图a夹心法、b预混法、c串联法

• General：芯片表面螯合Ni2+；
• Capture：捕获His标签配体 (Ligand in running buffer) ；
• Analyte：进样分析物，检测与配体的结合和解离过程。单循环实验中，可以在此步设置中一个循环设置多个浓度，直接得到浓度梯度的结果；
• Regeneration：用EDTA洗去Ni2+及配体。

熟悉His标签的老师可能会问：必须用EDTA再生么？当然不是。Kong et al. 使用NTA捕获法检测14–3-3ζ蛋白与化合物的结合时，化合物与靶点蛋白可以完全自发解离（快解离），因此不设置再生[1]；Lu et al. 使用NTA捕获法检测膜蛋白A2AR与化合物的结合，使用5 mM theophylline再生洗掉分析物而保留配体[2]。

图2：NTA芯片Capture & Coupling后，单循环检测ClpC3与药物的亲和力

“捕获”+“偶联”可使His标签配体蛋白稳定地共价结合在芯片。区别于CM系列芯片，NTA芯片并不通过静电吸附达到富集的目的，而是利用Ni²⁺与His标签的特异性结合，所以配体分子不需要使用低pH的醋酸钠缓冲液，用运行缓冲液稀释即可。

在Biacore控制软件中选择Immobilization-芯片类型选择NTA-add step-NTA Amine（Insight software of 1 series and 8 series， X100、T200及S200可在偶联方法中自定义偶联方法）即可开展实验。具体实验流程包括：

• General：芯片表面螯合Ni2+；
• Activation：EDC/NHS活化；
• Capture：捕获His标签配体 (Ligand in running buffer) ，同时发生捕获和偶联。除了设置配体进样时间外，Biacore特有的Aim for target level模式，无需紧盯偶联信号，不用担心偶联多了、少了，只需要输入想要的偶联量，仪器自动调整进样时间，准确达到目标偶联量。精准偶联So Easy；
• Deactivation 1：乙醇胺封闭；
• Deactivation 2：用EDTA洗去Ni2+。

图3：NTA芯片捕获+直接偶联，target模式下自动完成目标偶联量

在夹心法和串联法中，也可以同时在第二步进有A抗体背景的B抗体（二者的混合物）3来规避掉A抗体与抗原的解离。

氨基偶联

氨基偶联是将生物分子共价固定于传感芯片表面时使用最广泛的方法。CM3、CM4、CM5、CM7、C1、PEG芯片均可利用配体上的氨基来进行共价固定。氨基偶联原理如下图所示，传感芯片表面的羧基首先被EDC和NHS的混合物活化，从而生成具有反应活性的琥珀酰亚胺酯。然后，将配体分子流经传感芯片表面，琥珀酰亚胺酯与配体的伯胺基团或其他亲核基团发生反应，将配体共价连接于芯片上。

图1：通过氨基偶联固定配体的化学原理

相信各位老师对氨基偶联的方法也不陌生，那么我们带各位老师来温习一下。

这里所推荐的实验条件常用于一般目的的固定需求。配体浓度和进样时间是可以用来控制配体固定量的两个主要因素。如果偶联水平太高，可通过：

• 减少配体浓度；
• 减少进样时间；
• 减少活化时间来控制偶联量。如果需要较少的偶联量 (<500 RU) ，可尝试EDC/NHS以20%/80%混匀，活化30 s即可。

另外，Biacore还可以通过Aim for immobilized level程序实现目标量偶联，无需费心摸索，仪器轻松自动固定配体至合适的偶联量。

氨基偶联如果顺利完成，典型的传感图如下所示：

图2：利用氨基偶联固定配体的典型传感器图

配体巯基偶联

图3：通过配体巯基偶联固定配体的化学原理

图4：串联法的典型传感图

芯片表面巯基偶联

图5：通过配体巯基偶联固定配体的化学原理

图6：计算修饰配体程度的公式

实验第三步，就可以偶联配体了，推荐的实验程序如下：

Tips：进行配体/芯片表面巯基偶联时，运行缓冲液绝不能添加还原剂（如TCEP），因为还原剂会在偶联前还原PDEA，这样偶联化学反应就无法进行。

图7：利用表面芯片巯基偶联固定配体的典型传感器图

马来酰亚胺偶联

用氨基偶联化学反应将乙二胺偶联于传感芯片表面，形成具有氨基基团的表面。硫代-GMBS与氨基反应形成具有马来酰亚胺基团的表面，从而可用来固定含有巯基的配体分子（图4-16）。需要注意的是，氨基表面并不稳定，应在制备之后直接用硫代-GMBS失活。

图8：通过马来酰亚胺偶联固定配体的化学原理

如果芯片马来亚酰胺偶联顺利完成，典型的偶联图如下：

图9：利用马来酰亚胺偶联固定配体的典型传感器图

醛基偶联

图10：通过醛基偶联固定配体的化学原理

在固定之前，可使用高碘酸钠氧化法在含顺二醇的配体分子中引入醛基。这一步称之为氧化配体，推荐的程序如下：

氧化好的配体可按照推荐的程序进行偶联；

如果醛基偶联顺利，你将会看到以下典型的传感图：

图11：利用马来酰亚胺偶联固定配体的典型传感器图