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Biacore赋能“破冰行动”：带来靶向渐冻症TDP-43新希望

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肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS），也称为“渐冻症”，是一种进行性、致死性的神经退行性疾病，以运动神经元选择性丧失为特征，一般会导致肌肉萎缩、呼吸衰竭，患者中位生存期仅3-5年。

尽管约10%的ALS病例与明确基因突变相关（如SOD1、C9orf72），但超过97%的散发性及家族性ALS患者均存在病理性反式激活应答DNA结合蛋白（TDP-43）的异常。

此类病理改变不仅存在于ALS，也广泛见于额颞叶变（FTLD-TDP）等TDP-43蛋白病，共同构成“TDP-43蛋白病谱系”。

鉴于TDP-43病理与疾病进展的时空传播呈强相关性，且其异常聚集早于临床症状出现，靶向TDP-43的病理级联反应已成为突破当前治疗困境的核心策略。

瑞士生物制药公司AC Immune SA在《Acta Neuropathologica Communications》中发表文章，该研究首次证实：靶向TDP-43蛋白酶抗性淀粉样核心的免疫疗法，可通过阻断病理传播显著延缓或终止疾病进展。

图1：文章截图

多项早期研究表明，TDP-43的羧基末端（C端）结构域在模板化聚集中起到关键作用，因此本文报道了靶向TDP-43C端蛋白酶抗性淀粉样核心的单抗ACI-6677的开发工作。

图2：Biacore Single-Cycle检测结果

图3：ACI-6677的表位分析

作者用Biacore 8K，将TDP-43固定在CM5芯片表面，1.2-100 nM的ACI-6677作为分析物流过芯片表面，实验表明两个分子之间的亲和力高达380 pM。

后续又通过ELISA表位分析结果表明：TDP-43蛋白与单抗ACI-6677的结合表位为274-320区域。

通过构建靶向TDP-43致病性蛋白酶抗性淀粉样核心的单克隆抗体ACI-6677，该抗体对TDP-43具有pM级结合亲和力，且可结合所有C端TDP-43片段。

图4：ACI-6677可减少经FTLD-TDP脑提取物单侧接种的

CamKIIa-hTDP-43NLSm转基因小鼠中TDP-43病理的扩散

之后，文章又首次在疾病动物模型中证明，该抗体可中和具有播种能力的TDP-43，从而减少TDP-43神经病理的扩散。

动物实验结果证实了通过被动免疫疗法靶向细胞外致病性 TDP-43的重要性。这些发现也解释了其他已报道的结合TDP-43淀粉样蛋白核心区域或其远端的免疫疗法的有效性。

针对TDP-43淀粉样蛋白核心的单克隆抗体的成功制备，不仅为深入研究TDP-43C末端片段的病理生物学机制开辟了新途径，也为疾病分层提供了新的标准。

从发现TDP-43在中枢神经系统的扩散机制，到抗体中和其病理活性的突破，再到表位定位带来的精准治疗方向，这些研究成果为ALS等神经退行性疾病的治疗点亮了新的曙光。

未来，随着研究不断深入，基于开发的药物有望实现从延缓疾病进展到逆转病理损伤的跨越，为饱受ALS折磨的患者及其家庭带来治愈的希望。

我们期待科研成果加速转化，让创新疗法早日惠及每一位患者，共同见证神经退行性疾病治疗领域的全新变革！

Biacore

for your better life！

Biacore作为被中美日等多国药典收录的分子互作检测“金标准”，已广泛应用到基础科研与药物开发的多个领域。

截至目前，借助Biacore累计发表的文章已突破68000篇，超过100种的已上市药物的研发、申报、生产过程中也均有Biacore的身影。

我们同样期待越来越多神经退行性相关疾病的治病机制被发现、药物被开发，造福临床，造福人类。

Biacore点亮骨质疏松症治愈之路，让骨头重获“青春”

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骨质疏松症：

是一种全身性的骨骼老化或废用退化相关的代谢障碍性疾病，以骨量减少、结构退化、脆性增加，易发生骨折为特征。骨质疏松症并发症致残率高，严重影响患者的生活质量，给社会和家庭带来沉重负担，我国将其列为国家重点攻关的三大老年疾病之一。随着年龄的增长，骨代谢和体内平衡转向有利于过度激活的破骨细胞，从而导致骨质流失，这是骨质疏松症等疾病的标志。

由于破骨细胞的功能缺陷，Src基因缺失会导致严重的骨硬化，表明Src在破骨细胞中是必不可少的。因此，抑制Src激酶活性被认为是破骨细胞过度激活介导的骨质流失的有效治疗策略。G蛋白偶联受体 (GPCRs) 是约35%的获批药物的靶点，但目前尚不清楚GPCRs如何调节Src激酶活性，也不清楚这个GPCR是否可以作为治疗破骨细胞相关骨质流失的有效治疗靶点。

Src激酶去磷酸化抑制骨吸收并预防骨质流失

2024年2月12日，上海理工大学、海军军医大学上海长征医院、华东师范大学等科研单位合作在Nature子刊Nature Communications上发表了题为“Kisspeptin-10 Binding to Gpr54 in Osteoclasts Prevents Bone Loss by Activating Dusp18-mediated Dephosphorylation of Src”的研究论文，发现GPR54被其天然配体Kisspeptin-10 (Kp-10) 激活导致Dusp18去磷酸化Src激酶（图1）。Kiss1、Gpr54和Dusp18敲除小鼠均表现出破骨细胞过度激活和骨质流失，Kp-10通过抑制体内破骨细胞活性来消除骨质流失。因此，Kp-10/Gpr54是一个很有前途的治疗靶点，可以通过Dusp18介导Src激酶的去磷酸化来消除骨吸收。Biacore为GPR54与Src激酶相互作用以及GPR54与与Dusp18磷酸酶相互作用提供了关键数据。

图1：上海理工大学等发表在Nature Communications上的科学研究成果及其工作模型

首先，科研人员通过对基因敲除的遗传材料的分析，发现Kp-10/Gpr54主要通过抑制Src激酶的磷酸化水平来控制破骨细胞的形成和骨吸收。通过Biacore发现，GPR54的C端直接与Src激酶直接结合，亲和力KD高达2.595 nM（图2）。结果表明，Kp-10配体激活后的GPR54通过其C端招募Src激酶。

图2：Biacore检测GPR54与Src激酶结合的亲和力/动力学

基因敲除的遗传材料的分析，发现GPR54抑制Src激酶的磷酸化水平。那么，科研人员猜想，Kp-10刺激Gpr54后是否会招募一个磷酸酶来降低Src激酶的磷酸化水平？通过质谱分析发现了三个高潜力的磷酸酶DUSP18、PTPN6和PPP1CA。Biacore、CO-IP等结果显示，GPR54的C端与人源DUSP18磷酸酶、鼠源DUSP18磷酸酶均能结合，亲和力KD分别为40.27 nM和1.754 μM（图3）。综合以上结果表明，GPR54的C段在其配体Kp-10刺激下同时招募DUSP18磷酸酶和Src激酶。

图3：Biacore检测GPR54与人源DUSP18（左）、鼠源DUSP18磷酸酶（右）结合的亲和力/动力学

进一步，科研人员通过Biacore还发现，DUSP18磷酸酶与与Src激酶也能直接结合，亲和力KD高达5.887 nM（图4）。因此，GPR54的C段在其配体Kp-10刺激下，同时招募DUSP18磷酸酶和Src激酶，促进DUSP18磷酸酶对Src激酶的去磷酸化，从而抑制Src激酶的磷酸化水平。至此，科研人员发现了整个信号通路，为治疗破骨细胞相关骨质流失找到了有效治疗靶点。

图4：Biacore检测DUSP18磷酸酶与Src激酶结合的亲和力/动力学

当前骨质疏松最主流的治疗手段为通过靶向阻断RANK和RANKL的结合来抑制破骨细胞的活性，该合作团队早在2016年同样发表了关于骨质疏松症的研究论文，其工作发表在医学顶级期刊Nature Medicine上，题为“LGR4 is a receptor for RANKL and negatively regulates osteoclast differentiation and bone resorption”。本研究首次发现破骨细胞中最重要分化因子RANKL的一个新受体LGR4。Biacore为RANKL新受体的发现与确认提供了核心数据。

科研人员通过Biacore发现，全长LGR4胞外域与RANKL能够结合，并且亲和力KD高达52.2 nM。截短的LGR4胞外域与RNKL的结合明显减弱，KD为1.527 μM。而进一步截短的LGR4胞外域与RNKL不结合（图5）。表明，LGR4与RANKL直接结合，且完整的LGR4胞外域对于其与RANKL结合至关重要。在四个骨质疏松症小鼠模型中， LGR4-ECD处理后，降低了破骨细胞活性并增加了骨密度。因此，LGR4-ECD在体外和体内充当RANKL的分子诱饵受体，并抑制RANKL诱导的破骨细胞活化和骨质流失，从而有效改善骨质疏松症。

图5：Biacore检测RANKL与LGR4胞外域（全长、截短、更短）的亲和力/动力学

总结

Biacore作为唯一被中美日等多国药典收录的分子互作检测“金标准”，已广泛应用到基础科研与药物开发的多个领域。截至目前，借助Biacore累计发表的文章已突破60000篇，超过100种的已上市药物的研发、申报、生产过程中也均有Biacore的身影。同样期待越来越多骨科相关疾病的治病机制被发现、药物被开发，造福临床，造福人类。

参考文献：

Li, Zhenxi et al. “Kisspeptin-10 binding to Gpr54 in osteoclasts prevents bone loss by activating Dusp18-mediated dephosphorylation of Src.” Nature communications vol. 15,1 1300. 12 Feb. 2024, doi:10.1038/s41467-024-44852-9
Luo, Jian et al. “LGR4 is a receptor for RANKL and negatively regulates osteoclast differentiation and bone resorption.” Nature medicine vol. 22,5 (2016): 539-46. doi:10.1038/nm.4076

小分子、多肽、蛋白一网打尽，看Biacore在肾病药物研究中大显身手

2023年3月9日是第十八届“世界肾脏日”主题为“人人享有肾脏健康，未雨绸缪，支持弱势群体”。近年来慢性肾脏病已成为威胁人类健康的主要疾病之一，由于多数肾脏疾病早期没有特异的临床表现，慢性肾脏病又被称为”沉默的杀手”。而肾脏纤维化（renal fibrosis）是一种常见的病理生理途径，参与多种肾脏疾病的发展。

过往几年中，科研工作者对肾脏纤维化的研究逐步深入，发现了新的治疗靶点，并就此进行药物筛选和研发，今天小编选择了三篇近期国内科研工作者发表的文章，解读在该领域的研究中，用Biacore都解决了哪些问题？

NEU1在肾纤维化中的作用及药物筛选

2023年3月，中国药科大学，南京中医药大学等单位在Nature Communications上面发表题为“Neuraminidase 1 promotes renal fibrosis development in male mice”的文章，报道了神经氨酸酶1（neuraminidase 1，NEU1）在肾纤维化中的作用。研究认为NEU1与TGFβ I型受体ALK5的160-200aa区域结合，可以稳定ALK5，导致SMAD2/3激活，参与肾脏纤维化过程（图1）。

图1：NEU1在肾脏纤维化中的作用机制

文章采用Biacore对NEU1与ALK5的结合，以及结合的具体位置进行了验证。将重组的NEU1蛋白固定在芯片上，ALK51-125aa, ALK5162-403aa, ALK5200-503aa分别作为分析物进样，结果显示仅ALK5162-403aa与NEU1蛋白有结合，亲和力为3.14 nM（图2a）。据此作者认为ALK5的160-200aa区域是与NEU1结合的关键位置（图2c）。

图2：Biacore验证ALK与NEU1的结合，以及结合的关键位点

通过一系列的细胞及动物实验，研究人员确认NEU1在肾脏纤维化中的作用，并提出了以NEU1为靶点治疗肾脏疾病的潜在途径。采用SPR技术对74种药用植物的天然产物与NEU1的结合亲和力进行了筛选（图3a）。其中与NEU1的亲和力最强的是丹参中的活性成分丹酚酸B（salvianolic acid B），达到了21.57 nM（图3b）。随后研究人员在动物模型中比较了丹酚酸B与同样来自丹参的丹酚酸A的作用差异，同样剂量下，丹酚酸B明显表现出更好的缓解肾脏纤维化和肾脏损伤的效果，这与Biacore得到的两者与NEU1靶点的亲和力数据一致（图3）。

图3：针对NEU1靶点的天然产物筛选及表征

Klotho衍生多肽有效抑制肾纤维化

2022年，南方医科大学南方医院，广东工业大学，广州生物岛实验室等单位在Nature Communications上发表了题为“A Klotho-derived peptide protects against kidney fibrosis by targeting TGF-β signaling”的文章，发现一种Klotho蛋白衍生的多肽KP1可以通过靶向TGF-β信号传导保护肾脏纤维化，KP1通过结合TGF-β受体TβR2，抑制TGF-β下游信号通路的活化。

Biacore实验显示，多肽KP1与TβR2的亲和力达到1.41 μM（图4左），明显强于其他的Klotho蛋白衍生多肽KP12（KD=14.4μM，图4右）。后续的实验与Biacore的结果一致，高亲和力的KP1表现出明显的抑制肾脏纤维化的作用，能够有效保留肾脏功能，而KP12却没有表现出抑制TGF-β信号通路的效用。

图4：Biacore检测多肽KP1（左）和KP12（右）与TβR2的亲和力

新型融合蛋白缓解肾脏纤维化

2022年12月，复旦大学儿童医院，重庆医科大学第一附属医院等单位在Frontiers in Immunology发表题为“A novel fusion protein consisting of anti-ANGPTL3 antibody and interleukin-22 ameliorates diabetic nephropathy in mice”的文章，研究人员构建了一种新的融合蛋白，通过下调与肾脏损伤和功能障碍相关的信号通路，在糖尿病性肾病中显示出有效性。

该蛋白由IL-22与anti-ANGPTL3抗体的c端融合形成，文章通过Biacore验证了该融合蛋白的生物学活性（图5）。结果显示融合蛋白anti-ANGPTL3/IL22与anti-ANGPTL3抗体显示了相似的结合能力（图5C）。

图5，Biacore检测融合蛋白anti-ANGPTL3/IL22和anti-ANGPTL3抗体与ANGPTL3的亲和力

后续实验证明融合蛋白anti-ANGPTL3/IL22在保留生物活性的基础上具有更好的稳定性，通过抑制NF-κB P65和NLLRP3炎症小体的表达来缓解肾脏纤维化，在糖尿病性肾病小鼠中表现出明显的保护效果。

Biacore，

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消除肝炎不容等待，Biacore始终陪伴左右

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7月28日，又将迎来世界肝炎日。2021年，世卫组织（WHO）以“Hepatitis can’t wait”为主题庆祝世界肝炎日，呼吁各国共同努力，到2030年消除病毒性肝炎这一公共卫生威胁。病毒性肝炎是由多种肝炎病毒引起的以肝脏病变为主的一种传染病。病毒性肝炎的病原学分型，目前已被公认的有甲、乙、丙、丁、戊五种肝炎病毒，分别写作HAV、HBV、HCV、HDV、HEV，除乙型肝炎病毒为DNA病毒外，其余均为RNA病毒。WHO的数据显示，全世界有超过 3.54 亿人患有慢性肝炎；尽管现在已有有效的HAV、HBV疫苗，但每天仍新增近万例的肝炎感染，每年有超过 140 万人死于晚期肝病和肝癌。我国是世界范围内的肝炎大国，其中仅乙肝和丙肝感染者就高达1亿人。因此，高效、特异的药物研制尤为迫切，消除肝炎不容等待。

近年来，中国科学家在抗多种肝炎病毒（HAV、HBV、HCV、HDV、HEV）药物的设计与发现中硕果累累，为全人类的健康贡献非凡。Biacore作为分子互作的“金标准”，已助力近五万篇文章的发表与上百款药物的上市，在肝炎药物的研究中，Biacore同样表现出色！接下来，小编带大家赏析几篇Biacore与肝炎药物设计和发现的故事。

图1 世卫组织提出“消除肝炎不容等待”的口号

甲型肝炎HAV：保守抗原表位的发现与高效抑制剂的合理设计

中科院生物物理研究所、四川大学等单位合作在《Plos Biology》上发表了题为“Structural basis for neutralization of hepatitis A virus informs a rational design of highly potent inhibitors”的研究成果，该研究发现甲型肝炎病毒只有一个保守的抗原表位，基于该抗原表位，他们发现一种用于头颈部癌症治疗药物golvatinib可以作为治疗甲型肝炎病毒感染药物开发的先导化合物。

科研人员筛选分离得到了4个HAV中和性抗体（F4, F6, F7和F9），加上先前实验获得的中和性抗体R10，至此获得了5个中和性抗体。然后使用Biacore，检测HAV全颗粒与5个中和抗体的亲和力KD和动力学（Ka和kd）（图2）。结果显示，5个中和性抗体（F4, F6, F7, F9和R10）与HAV均能结合，并且亲和力均高达nM级别，分别为5.14 nM, 2.19 nM, 7.10 nM, 7.18 nM和8.13 nM。

图2 Biacore实验证明，5个中和性抗体（F4, F6, F7, F9和R10）与HAV全颗粒均能结合

为了进一步了解5个中和性抗体识别HAV的相同表位还是不同表位，科研人员使用Biacore进行了表位分析（Epitope binning）（图3）。结果显示，R10 的结合阻止了其他 4 个中和性抗体与 HAV 的结合，表明这 5 个中和性抗体结合在HAV的同一块表位，该数据与高分辨率冷冻电子显微镜 (cryo-EM) 结构结果高度一致，这表明 HAV 的这个抗原表位可作为药物设计的主要目标。基于该保守抗原表位，科研人员进行了计算机虚拟筛选，从 DrugBank 数据库中成功鉴定了一种名为golvatinib的潜在抑制剂。体外测定证实了其阻断病毒感染的能力并揭示了其中和机制。该方法可用于设计治疗小核糖核酸病毒感染的有效药物。

图3 Biacore实验证明，5个中和性抗体（F4, F6, F7, F9和R10）的表位相同

乙型肝炎HBV：基于疫苗诱导的治疗性抗体药发现

厦门大学在《Antibody Therapeutics》上发表了题为“Novel monkey mAbs induced by a therapeutic vaccine targeting the hepatitis B surface antigen effectively suppress hepatitis B virus in mice”的研究成果，该研究发现HBV疫苗诱导的单克隆抗体（hu1-23 和 hu3-23）可有效抑制乙型肝炎病毒，是具有伟大前景的乙型肝炎治疗性候选药物。并且，该研究也为药物的研发提供了新思路。

科研人员从接种CR-T3-SEQ13 (HBsAg aa 113-135) 疫苗的食蟹猴中分离出多个anti-HBsAg的单克隆抗体，其中C1-23和C3-23显示出最好的HBsAg 清除率和病毒抑制功效。进一步对C1-23和C3-23进行人源化改造，分别命名为hu1-23和hu3-23。使用Biacore，对二者与HBsAg的亲和力KD检测，结果显示亲和力均在nM级别，分别为1.06 nM和1.12 nM（图4）。

图4 Biacore实验证明，hu1-23和hu3-23与HBsAg的亲和力均在nM级别

乙型肝炎HBV：基于phage display的治疗性抗体药发现

复旦大学、普陀中心医院等单位合作在《Mabs》上发表了题为“A human monoclonal antibody against small envelope protein of hepatitis B virus with potent neutralization effect”的研究成果，该研究利用phage display和Biacore相结合的方法，找了能够特异性结合HBV小包膜蛋白(S)的单克隆抗体G12，并且该抗体能够显著降低小鼠的血清 HBsAg 滴度，具有潜在治疗效果。

科研人员通过phage display筛选到了HBFab12和HBFab21，据此构建为IgG1单克隆抗体，分别命名为G12和G21。为进一步验证两个单克隆抗体与HBV小包膜蛋白(S)的结合情况，科研人员使用Biacore，对其亲和力KD和动力学（Ka和kd）进行检测，结果显示G12和G21与抗原的亲和力均在nM级别，分别为7.56 nM和8.04 nM（图5）。在 HBV 持续存在的转基因小鼠模型中，单次腹腔注射 G12 显着降低了所有 7 只小鼠的血清 HBsAg 滴度，表明G12是治疗乙型肝炎的潜在候选药物。

图5 Biacore实验证明，G12和G21与HBV小包膜蛋白(S)的亲和力均在nM级别

丙型肝炎HCV：新型强效NS5B 聚合酶抑制剂的发现

南开大学、天津市国际生物医药联合研究院等单位合作在《Plos One》上发表了题为“Discovery of Novel Hepatitis C Virus NS5B Polymerase Inhibitors by Combining Random Forest, Multiple e-Pharmacophore Modeling and Docking”的研究成果，该研究利用虚拟筛选和Biacore相结合的方法，找到了5 个潜在的HCV NS5B 聚合酶抑制剂供进一步优化和开发，作为治疗丙型肝炎病毒感染药物开发的先导化合物。

科研人员采用基于随机森林 (RB-VS)、电子药效团 (PB-VS) 和对接 (DB-VS) 的虚拟筛选方法，筛选 InterBioScreen 数据库，最终获得了5个潜在的靶向HCV NS5B 聚合酶的化合物。为验证虚拟筛选得到的化合物是否与NS5B结合以及亲和力KD数据，研究人员使用Biacore进一步验证，结果显示，各化合物与NS5B的结合均在μM 级别（KD = 4.67–123.1 μM），其中N2与NS5B的结合最强（图6），与抗病毒活性的结果一致（EC50）。另外，所有化合物均能抑制 HCV NS5B 聚合酶的活性（IC50），并且除了N2显示出较弱的细胞毒性，其他均无细胞毒性（CC50 > 100 μM）。至此，找到了5 个潜在的HCV NS5B 聚合酶抑制剂供进一步优化和开发，作为治疗HCV感染药物开发的先导化合物。

图6 Biacore实验证明，化合物与NS5B的结合均在μM 级别

丁型肝炎HDV和乙型肝炎HBV：

清华大学、NIBS、北京大学等单位合作在《eLife》上发表了题为“A potent human neutralizing antibody Fc-dependently reduces established HBV infections”的研究成果，该研究发现了一种有效的靶向 preS1的中和抗体，一方面可以阻止乙型肝炎HBV和丁型肝炎HDV的感染，同时又能通过与FcγRs的结合，杀死已经入侵的HBV病毒，从而为 HBV 治疗提供了一种新的抗体-Fc 依赖性策略。

科研人员从噬菌体文库中鉴定了六个抗 preS1抗体，进一步实验表明，其中抗体2H5-A14 通过结合preS1 ，抑制其与 NTCP 的结合，从而阻止乙型肝炎HBV和丁型肝炎HDV的感染。为了进一步验证 2H5-A14 的 ADCC 活性，科研人员使用Biacore，检测了抗体2H5-A14与FcγRs受体的结合情况，结果显示2H5-A14与FcγRs受体均能结合（图7），表明中和性抗体2H5-A14 可以通过Fc-FcγR互作依赖的效应功能（如ADCC）杀死靶细胞。

图7 Biacore实验证明，2H5-A14与FcγRs受体均能结合

由此可见，Biacore广泛应用于各型肝炎病毒药物的研究，在肝炎病毒药物研究的道路上，始终有Biacore相伴！相信在不久的将来，多种肝炎特效药将陆续上市，造福数以亿计的患者。

自 1990 年上市至今，Biacore作为唯一被中美日药典收录的分子互作检测“金标准”，已广泛应用到基础科研与药物开发的多个领域。截至目前，借助 Biacore 累计发表的文章已近50000 篇，超过百种的已上市药物的研发、申报、生产过程中也均有 Biacore 的身影。相信有了Biacore助力“产学研”，未来一定会有越来越多的药物从研发走向上市。

早筛查，早诊疗，向“为时已晚”说拜拜！

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4月15日，第28届全国肿瘤防治宣传周正式展开，本次宣传主题为“整合资源，科学防癌”。活动响应《“健康中国2030”规划纲要》要求，首次将宣传重点推向了 “科学防癌，关口前移”、“关注早筛，防患未然”等方面。根据世界卫生组织国际癌症研究机构发布的2020年全球最新癌症数据，2020年我国癌症新发病例457万例，每分钟有8人被确诊癌症！通过此次宣传，中国抗癌协会旨在推动癌症防治，倡导做到早预防、早发现、早诊断、早治疗，降低癌症发病率和死亡率。

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的原发性肝癌，是全球发病率前十的癌症之一，但它却是全球第二大癌症死亡原因(占所有癌症死亡的9.1%)。肝癌防治过程中最大的挑战，便是往往就诊已晚期，失去接受根治性手术的机会。因此完善肝癌早期筛查对于挽救肝癌患者至关重要。检测血清生物标志物是早期HCC筛查的关键手段。一系列用于HCC诊断的血清生物标志物已被报道，如甲胎蛋白(AFP)，脱氧-γ-羧基凝血酶原(DCP) 、中基蛋白（MDK）和 Dickkopf-1（DKK1）等。DKK1最早于1998年被发现，是典型Wnt信号通路的分泌拮抗剂，在来自HCC及其他癌细胞系的培养基中可以检测到高水平的DKK1分泌。DKK1早期诊断HCC的敏感性为70.9%，特异性为90.5%，是HCC的潜在诊断标志物，是非常好的早期筛查指标。

复旦大学附属华山医院消化科团队在生物分析化学杂志Talanta发表了题为“Developing Slow-off Dickkopf-1 Aptamers for Early-diagnosis of Hepatocellular Carcinoma”的文章，该团队开发了针对Dickkopf-1的慢解离核酸适配体，可配合抗体形成核酸适配体-靶标-抗体的HCC早期筛查ELISA方法，进一步降低筛查成本，提高筛查的效率。在筛选与改造过程中，Biacore为核酸适配体的筛选指标提供了关键数据。

研究人员在以指数富集的配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)对DKK1核酸适配体文库筛选后，使用Biacore T200将DKK1固定在CM5传感器芯片上，并将候选适配体作为分析物进行亲和力/动力学检测。如图1、2、3及表1所示，筛选获得的三类核酸适配体D5/D10/D17与DKK1的KD分别为12.26nM、24.85 nM、21.81 nM，均在同一数量级，而三者的解离速率却大有不同，其中D10的kd值是D5和D17的10倍。与快速解离的核酸适配体相比，慢解离的适配体可以大大降低基于适配体的临床ELISA检测的假阴性，极大地提高了HCC早期筛查的准确率与效率。

候选核酸适配体D5(图1 ）、D10(图2）与DKK1的亲和力/动力学传感图

表1 候选核酸适配体与DKK1的亲和力/动力学

检测过程中，研究人员使用了包括点印迹法、酶联核酸适配体吸附试验(ELASA)、Pull-down、流式细胞术和Biacore进行检测。结果表明，不同的方法对相同的序列可能会得到不同结果，相互比较后，研究者强烈建议通过使用Biacore完成候选适配体性能验证，因为这种方法同时提供实时的动力学信息。

基于对核酸适配体D10的检测结果，对DKK1核酸适配体文库进一步进行慢解离筛选，获得适配体D10的突变体C29T，及C29T基础上34位缺失的34del。研究人员使用Biacore以及上述已固定DKK1的CM5传感芯片，以C29T、34del作为分析物，对全新的候选适配体进行亲和力/动力学检测，结果如图4、5及表2所示。候选核酸适配体C29T与34del的KD分别为8.062nM、371.9 pM，比适配体D10的亲和力提高了3.1倍和66.8倍。除此之外，适配体34del的kd已经达到了7.374×10-5s-1，获得了极慢解离的核酸适配体。在对其进行结构预测后，证明截短序列可以进一步提高结合能力，并在其基础上进一步截短，获得全新优化的核酸适配体TD10，将其用于后续HCC筛查。

候选核酸适配体C29T（图1）、34del（图2）与DKK1的亲和力/动力学传感图

表2 慢解离候选核酸适配体与DKK1的亲和力/动力学

后续实验中，研究人员使用优化后的DKK1核酸适配体TD10，将其与商业化HCC早期筛查抗体试剂盒进行对比，发现两者检测范围均能达到62.5 ~ 4000 pg/ml，并且使用基于适配体的ELISA的DKK1水平相对于传统方法而言，可以通过修正系数进行调整。此外，基于适配体的ELISA可以进一步降低筛查成本，提高筛查效率，为肝癌早期筛查进一步助力。

在该研究中，研究者使用了不同检测方法后，强烈推荐使用Biacore对适配体性能进行筛查，因为Biacore不仅仅提供亲和力检测数据，同时还呈现了动力学数据，ka表示结合速率常数，代表结合快慢；kd表示解离速率常数，代表解离快慢，通过kd的数据比较获得了优选的慢解离核酸适配体。同时，由于Biacore的动力学检测范围非常广，并且具有极佳的基线稳定性，对于高亲和样品的检测毫无压力，非常适合pM亲和力级别的核酸适配体筛选。除此之外，由于Biacore的传感芯片可以在保证固定分子活性情况下，无限次使用，所以在多批次多类型候选适配体检测过程中，只需要使用1/2块CM5芯片，如果是基于Biacore 8K Series系统，只需要使用1/8块CM5芯片，大大降低研发成本。

在助力核酸适配体筛选之余，Biacore也同样助力各类不同癌症早筛方法的建立。

日本千叶县癌症中心的研究团队，使用Biacore发现KRAS5可以作为特异性富集因子，富集ctDNA中的KRAS突变，并使用dPCR进行检测，大大提高了筛查灵敏度，在早期ctDNA水平较低的情况下，建立了结直肠癌患者的早期筛查和诊断方法。
日本东部国家癌症研究中心的研究团队，使用Biacore发现了组织因子（TF）的单链抗体，可以作为免疫探针，配合MRI、PET等分子成像技术，实现对胰腺癌、胃癌、脑癌等各类实体瘤的早筛。

同时，Biacore也致力于为各类癌症早筛提供直接检测方案。

加州大学洛杉矶分校的研究团队，使用Biacore开发了一种针对唾液样本的直接检测方法，通过使用抗体三明治法对样本中的IL-8进行检测，仅需13分钟即可得到结果，为口腔鳞癌患者的早筛提供了极大的便利。
澳大利亚格里菲斯大学的研究团队就使用Biacore开发了一种临床样本的直接检测方法，使用该方法检测乳腺癌患者的血清样本，确定了Neu5Gc是乳腺癌筛查与监测的重要生物标志物，为乳腺癌早筛提供依据与方法。

作为分子互作的金标准，Biacore在三十多年的积淀中，为各类癌症疾病的筛查、诊断、治疗等领域提供技术支持，为人类健康提供了核心助力。

参考文献：

[1] Yin, Zhou, Wenshuai, et al. Developing slow-off dickkopf-1 aptamers for early-diagnosis of hepatocellular carcinoma[J]. Talanta, 2019.
[2] Enrichment technique to allow early detection and monitor emergence ofKRASmutation in response to treatment[J]. Scientific Reports, 2019, 9(1).
[3] Sato R , Obonai T , Tsumura R , et al. Preparation and characterization of anti-tissue factor single-chain variable fragment antibody for cancer diagnosis[J]. Cancer Science, 2015, 105(12).
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[5] Shewell L K , Day C J , Kutasovic J R , et al. N-glycolylneuraminic acid serum biomarker levels are elevated in breast cancer patients at all stages of disease. 2021.

金牌背后的伤痕，愿为你抚平 — Biacore助力伤口愈合新机制研究

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2022北京冬奥即将落下帷幕，我们激动于中国短道速滑一次次的坚定冲线，赞叹于谷爱凌偏轴转体两周1620°的成功，感动于羽生结弦挑战阿克塞尔四周跳的人类极限，遗憾于一代传奇肖恩怀特谢幕表演未能摘得奖牌，他们呈现给冬奥会的只有光鲜靓丽，但谁又知他们早已满是伤痕！28岁的武大靖因伤病拥有一双饱经沧桑五十岁的脚，谷爱凌曾在滑雪练习中摔至脑震荡，羽生结弦多次重伤右足无法行走，肖恩怀特撞到U型池至面部差点毁容，每一位运动员无不伴随着一身的伤病。大家只看到了他们飞得多高，但我们也关心他们伤得多重！为此，各国科学家都在探索更好的伤口愈合方法，让运动员们以及各类患者们可以更快愈合伤口，继续书写他们的热血人生！
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2019年，美国芝加哥大学分子工程研究所的 Jeffrey A. Hubbell教授团队，在血液学顶级期刊Blood（IF：22.113）上发表了一篇题为“The heparin binding domain of von Willebrand factor binds to growth factors and promotes angiogenesis in wound healing”，揭示了加速伤口愈合的全新机制。该团队发现血管性血友病因子（VWF）与多种生长因子(GFs)，可以通过VWF A1结构域内的肝素结合结构域(HBD)结合，进一步提高GF在创面部位的保留时间，促进血管生成，加速伤口愈合。作为分子互作金标准的Biacore，在证明VWF与多种GFs结合的重要环节上起到关键作用。

在伤口愈合过程中，生长因子(GFs)的分布、作用发挥和信号转导是通过它们与伤口微环境中的细胞外基质成分结合来协调的。细胞外基质蛋白与GF结合被证明可以用来调节血管生成和促进伤口愈合。血管性血友病因子(VWF)是由内皮细胞(ECs)和巨核细胞合成的一种大型血浆糖蛋白。它最主要的功能是介导血小板粘附在损伤部位的内皮下，并作为凝血因子VIII(FVIII)的载体，完成止血作用。常见的遗传性出血疾病血管性血友病(VWD)，就是由VWF缺陷或缺乏引起的。而在一些VWD患者中发现了迟发性伤口愈合的症状，那是否VWF在伤口愈合中也发挥重要作用呢？

研究人员在进行动物实验后确定VWF缺乏会导致小鼠伤口愈合延迟，确认VWF的确参与了促进皮肤组织修复。随后，他们使用Biacore将血浆来源的VWF固定在C1芯片上，将不同类型的生长因子，包括VEGF121、VEGF-A165、PDGF-BB、NT-3、PDGF-DD等作为分析物流经芯片表面进行亲和力/动力学检测。结果显示，不含HBD结构域的VEGF121与VWF不结合（图1）；而其他含有HBD结构域的GFs（VEGF-A165、PDGF-BB、NT-3、PDGF-DD）均能与VWF结合（图2），其中VEGF-A165与VWF的亲和力KD值为27 .4nM，PDGF-DD和VWF的KD值为12.6 nM，这些数据表明，VWF A1域的HBD是介导WWF与GF结合的关键结构。

图1. Biacore检测不含HBD的VEGF121与VWF不结合

图2. Biacore证明VEGF-A165、PDGF-BB、NT-3、PDGF-DD通过HBD结构域与VWF结合

除此之外，研究人员通过HBD域的R1341突变验证及肝素过量实验证明，VWF中存在一个以上的GF结合位点。因此研究人员选用Biacore分析软件中独特的Heterogeneous ligand模型对PDGF-BB与NT-3和VWF的互作结果进行分析，其KD值为23.8 nM与0.16 nM。同时，由不同的GFs与VWF的亲和力数值可以看出，其KD值均为nM级别，证明VWF与各类肝素结合GFs具有很强的亲和力。而高亲和力带来的保留GFs的能力，正是VWF促进伤口愈合的重要途径。

后续实验中，研究人员合成带有HBD结构域的VWF-HBD肽，并使用其将纤维蛋白基质功能化。使用VWF-HBD功能化的纤维蛋白基质治疗VWF缺陷小鼠伤口时，小鼠伤口中GFs的数量增加并促进血管生成，加速伤口愈合。该研究证明VWF是一种新型的具有保留GFs能力的保存库，可以促进伤口愈合，同时VWF-HBD也可以作为一种可能的新型工具来促进伤口愈合。

在该研究中，研究人员首先在动物实验中确定了VWF对于创面愈合的生理和临床意义，然后利用Biacore在分子水平上对VWF与不同GFs的结合进行了验证，证明了结合的关键位点。值得注意的是，其中NT-3与VWF的亲和力KD值已经到达10-11级别，Biacore能够轻松检测到低至fM级别的亲和力，从而确保pM级的结合也能准确检测。此外Biacore还提供多种数据拟合模型（1:1binding；Bivalent Analyte ，Heterogeneous Ligand，Heterogeneous Analyte，Two State Reaction），满足不同结合模式的分析需求。同时，Biacore配备C1、CM5、CM7、SA、Protein A等一系列芯片，能够实现对几乎所有类型的生物样本进行检测。

冬奥会马上就要落下帷幕，恭喜所有奖牌获得者的同时，也感谢所有参赛者们。感谢你们向我们展示了真正的奥林匹克精神，我们将在你们的精神鼓舞下努力生活！而Biacore也将助力更多伤口愈合全新机制的探究，致力于给到各类满是伤痕的患者与运动员一种更快、更有效的伤口愈合方式，希望大家远离伤病，在自己的体育道路、人生道路中飞得更高，走得更远！

Biacore，

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